不同產地待宰生豬的非洲豬瘟病毒檢測

鐘 東，寧廣南，牟禮乾*，王永妮，梁雄燕，宋運福

（1.廣西玉林市福綿鎮水產畜牧獸醫站，廣西 玉林 537023；2.廣西玉林市沙田鎮水產畜牧獸醫站，廣西 玉林 537034；3.廣西玉林市福綿區動物疫病預防控制中心，廣西 玉林 537023；4.廣西玉林市仁厚鎮農業農村綜合服務中心，廣西 玉林 537012；5.廣西玉林市成均鎮水產畜牧獸醫站，廣西 玉林 537024）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起豬的一種高致病性、高死亡率、急性傳染性疾病，世界動物衛生組織（OIE）將ASF 列為法定報告動物疫病，該病也是各國重點防范的一類動物疫情。2018 年8 月遼寧省沈陽市出現國內首例非洲豬瘟疫情，隨后蔓延至國內各地，2019 年5 月廣西玉林市博白縣發生非洲豬瘟疫情［1］。為有效阻斷ASF 疫情蔓延，廣西壯族自治區農業農村廳相繼下發文件，要求生豬定點屠宰企業（廠、場）建設非洲豬瘟PCR 檢測實驗室，并對產地生豬及生豬產品采取“點對點”調運備案管理。屠宰企業是生豬調運的終點站，對不同產地待宰生豬進行采樣檢測有著重要意義，可有效檢驗不同產地生豬養殖場（戶）對非洲豬瘟病毒防控是否到位，官方獸醫產地檢疫是否嚴謹等。本研究對玉林市福綿區某屠宰企業不同產地的待宰生豬采集全血樣本進行熒光PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 冰箱，可調移液器及吸頭，1.5 mL離心管，防護用品，高速臺式離心機，熒光PCR儀及配套反應管等。

1.2 主要試劑 非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒，包含：陰性對照、陽性對照、樣品稀釋液、熒光PCR反應液。

1.3 樣品采集 非洲豬瘟病毒樣品可從豬肉、豬血管、淋巴結、脾臟等部位采集。本次檢測主要使用生豬全血作為樣本，為提高檢測效率。同一來源地的生豬最多100頭為1份混合血樣［2］，使用無菌注射器抽取200 μL 生豬全血樣本至1.5 mL無菌離心管中，待檢。

樣本采集后應及時檢測，未能及時檢測的需保存于-20 ℃冰箱中，樣本保存期間應避免交叉污染。

1.4 檢測方法

1.4.1 試劑準備 實驗前30 min 從冰箱中取出試劑盒（試劑盒保存條件為-20 ℃），待恢復至室內溫度（15～25 ℃）使試劑完全融化［3］。按照單反應體系配制方法，將試劑分裝至PCR 反應管中，擰緊反應管蓋子，其余試劑返回冰箱-20 ℃冷凍保存。

1.4.2 樣本準備 DNA 提取：為避免DNA 酶受到污染并保護操作者，進行下述操作時必須佩戴一次性手套和口罩。

（1）待檢樣品份數要求為n份，則取n個無菌的1.5 mL離心管，并對離心管編號。

（2）離心管中加入樣品稀釋液80 μL。

（3）離心管中分別加入已處理的待檢樣品20 μL，充分混勻，室溫下放置2 min。

（4）離心機設置5 000 r/min 離心1 min，取上清20 μL 即為待檢DNA 模板。提取好的DNA 模板如不能立即檢測的，建議放冰箱中-20 ℃以下保存。

1.4.3 加樣 打開裝有PCR 反應液的反應管分別向其中加入已提取的樣本模板（標記：A1、A2、A3），陽性對照（標記：C2），陰性對照（標記：C1）各2.5 μL，在記錄本上記錄加樣順序。

將所有的反應管振蕩混勻后以2 000 r/min離心10 s，隨即轉到PCR擴增步驟。

1.4.4 PCR 擴增 啟用熒光PCR 儀預熱并檢驗儀器性能。將準備好的PCR 反應管放置于熒光PCR儀樣品槽，并記錄放置順序。設置熒光PCR 儀參數進行擴增。參數設置為：50 ℃孵育2 min；95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環；在每一循環的60 ℃時收集FAM通道采集熒光信號。

2 結果判定

詳見表1。

表1 Ct值結果判定

3 檢測結果

按上述操作流程，從2022 年3 月1 日至3 月10日開展實驗檢測，每日對生豬采集全血樣本并作熒光PCR 檢測，檢測樣本數為3 份（樣本標記：A1、A2、A3），累計采集750 頭生豬全血樣本。結果顯示：生豬全血樣本無Ct值，判定均為陰性，詳細檢測數據見表2。

表2 PCR檢測生豬全血樣本Ct值

4 結論

PCR 檢測結果表明，在當地嚴格的防控要求下，不同產地的生豬均未檢出非洲豬瘟陽性，證明非洲豬瘟疫情防控措施取得了積極效果。生豬養殖在產地、運輸車輛、運輸路徑、屠宰銷售等環節形成了健全的、可追溯的長效機制，最大限度地降低了非洲豬瘟疫情對經濟社會造成的不利影響。但受限于實驗室設備及人手不足等因素，檢測的樣本較為單一，僅使用了生豬全血作為PCR檢測樣本，下一步將增加生豬樣本采集部位，以進一步論證不同產地生豬養豬場（戶）等在貫徹落實當地非洲豬瘟防控策略中的實際效果。