農村有機生活垃圾干發酵氨脅迫下中試工藝

劉洋，葉小梅，苗曉，王成成，賈昭炎，曹春暉，奚永蘭，3

（1 江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014；2 江蘇大學農業工程學院，江蘇 鎮江 212013；3 農業農村部種養結合重點實驗室，江蘇 南京 210014；4 徐州市環能生態技術有限公司，江蘇 徐州 221000）

我國提出“碳達峰碳中和”（雙碳）目標為我國農村生活垃圾處理提出了新的要求。在對農村生活垃圾進行處理時，還需考慮碳排放和碳減排問題，為早日實現“雙碳”目標做出貢獻。農村生活垃圾是制約我國農村環境改善的重要因素，每年約2.94 億噸的農村生活垃圾需要處理[1]。厭氧發酵是處理農村生活垃圾有機部分極具潛力的技術[2]，在處理固廢的同時生產清潔能源沼氣，對碳減排的貢獻同樣潛力巨大[3]。因此進一步提高厭氧發酵效率，深挖厭氧發酵產甲烷潛力是必要的。

提高厭氧發酵罐內總固體（total solid，TS）含量可以提高池容產氣率，降低沼液產出，具有加熱能耗低和沼渣后處理容易等優點，因此近年來TS含量較高的干式厭氧發酵技術受到更多關注[4-6]。干式厭氧發酵一般指TS≥20%（樣品烘干后重量/樣品重量）的厭氧發酵[7]，農村有機生活垃圾的含水率在80%（樣品水分重量/樣品重量）左右[8]，可直接用于干式厭氧發酵而不需加水調節TS。提高發酵罐內TS 含量會直接導致系統內部揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）和氨氮快速積累，對產甲烷菌產生嚴重的抑制，破壞發酵系統平衡[9-12]。本文作者課題組先前的研究表明農村有機生活垃圾厭氧發酵TS含量達到8%已經出現氨氮抑制[13]，TS達到20%時出現嚴重氨氮抑制[14]。解決氨氮抑制包括接種物馴化、共發酵和氨氮吸附材料等方法，均對高濃度氨氮抑制有顯著效果[8,15-16]，其中共發酵是增加農業廢棄物厭氧發酵甲烷產量的最常用方法[17]。畜禽糞便作為農業碳排放的主要來源之一，直接對其進行厭氧發酵由于其產沼氣潛力低而不具有經濟性。其中牛糞具有提高厭氧發酵系統緩沖能力，緩解氨氮抑制的作用[18]，同時其高碳含量可以作為生活垃圾等富氮原料干式厭氧發酵的共發酵底物[19]。因而將農村有機生活垃圾與牛糞進行干式厭氧共發酵的研究是有意義的，可以通過兩種原料的性質互補，提高產甲烷效率。同時對農村有機生活垃圾的研究多集中在實驗室規模，其工程化應用研究尚少。

本文通過對農村有機生活垃圾和牛糞進行1m3規模的中溫干式厭氧共發酵中試試驗，考察了農村有機生活垃圾在中試規模下的產甲烷、氨氮、VFAs 和微生物群落的特征，以期獲得農村有機生活垃圾氨脅迫下中試規模的發酵特征和潛力，給農村有機生活垃圾沼氣工程建設提供技術支持，為農村有機生活垃圾無害化處理和“雙碳”目標實現做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參考江蘇省徐州市沛縣大屯街道大王莊生活垃圾分類處置中心的組分[20]，農村有機生活垃圾由江蘇省農業科學院食堂的餐廚垃圾尾菜、江蘇省農業科學院六合動物科學試驗基地的蔬菜秸稈和農作物秸稈粉碎混合而成，混合后采用粉碎機粉碎在-20℃保存。執行試驗時至南京優然牧業有限責任公司獲取鮮牛糞。農村有機生活垃圾和牛糞的理化性質見表1。接種物取自徐州市環能生態技術有限公司，在發酵罐中使用農村有機生活垃圾37℃±1℃馴化后使用。

表1 底物理化性質

1.2 試驗設計

設置發酵罐內TS 質量分數為20%，生活垃圾與牛糞濕重比為3∶1，生活垃圾共進料330kg，牛糞進料110kg，揮發性固體含量（volatile solid，VS）為56.354kg。進料完成后將農村有機生活垃圾、牛糞與接種物攪拌均勻，取樣測得發酵罐內TS 質量分數為19.94%。厭氧發酵裝置為太陽能厭氧罐系統（徐州市環能生態技術有限公司，徐州），容積為1m3，臥式發酵罐，初始pH 7.5，37℃±1℃中溫發酵，發酵周期為130天。發酵裝置配置有甲烷含量檢測器，實時數據可自動上傳至云端，沼氣產量采用燃氣表計量，通過監控實時傳輸數據。每10天取樣測VFAs濃度和氨氮濃度，在發酵第0 天（B20_1）、第65 天（B20_2）和第130 天（B20_3）取樣進行微生物群落分析。

1.3 分析方法

TS 和VS 采用APHA 的方法[21]。試驗樣品有機碳測定采用稀釋熱法，全氮測定采用凱氏定氮法[22]。pH 使用pH 計（LAQ UAtwin-pH-22，日本）直接測定。VFAs 由氣相色譜儀測定（島津GC-2014，日本），色譜柱為：DB-FFAP 30m×0.25mm 0.25μm，FID檢測器，氮氣為載氣，進樣口溫度為250℃，FID溫度為300℃，分流比為1∶10，柱箱升溫程序為：先在100℃下保持5min，然后以10℃/min速度升到250℃，保持312min，進樣量為1μL[13]。氨氮的測定采用氨氮快速測定儀（5B-6D，連華）。微生物群落分析取樣時在發酵罐出料口直接出料取發酵混合物，后離心取樣品固體部分，采用干冰保溫箱寄送至上海美吉生物科技有限公司進行測序系列工作。微生物群落分析包括DNA 抽提、設計合成引物接頭、PCR 擴增、構建文庫和Ⅰllumina 測序。分析完成后在美吉生物云平臺進行分析（https://cloud.majorbio.com）。古菌的引物名稱為524F10extF_Arch958RmodR，細菌的引物名稱為338F_806R。

2 結果與討論

2.1 產氣量分析

本批次中試試驗共進行130天，發酵過程中日沼氣產量和累積沼氣產量變化如圖1所示。發酵系統啟動迅速，第2天出現最大峰值。同時由于發酵時間持續較長，發酵過程中出現多次峰值，可能是由于發酵過程中季節跨度較大，環境溫度變化導致發酵罐內溫度出現波動。本試驗采用的接種物為中溫發酵所用，因此溫度變化可能導致不同時間微生物生命活動水平不同，造成沼氣產量的波動。發酵結束時累積沼氣產量為70.585m3，單位VS 沼氣產量達到了1.253m3/kg，其沼氣產率遠超實驗室小試的最大值（0.509m3/kg和0.633m3/kg）[2,8]。

圖2為農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵過程中甲烷含量及甲烷產量變化。甲烷含量的高低可以直觀判斷厭氧發酵系統運行狀況[23]，一般認為甲烷體積分數大于50%發酵系統處于正常運行狀態[23-24]。發酵開始后甲烷含量迅速上升，隨后維持在70%小幅度波動。發酵第63 天甲烷含量出現了降低，在57%穩定3天后又上升至70%左右。此次波動與該時間段內氣溫降低有關，較低的氣溫影響太陽能系統傳熱效率，需要更長的時間維持發酵罐內溫度，造成罐內溫度較低。高甲烷含量可能與發酵過程中較高的氨氮濃度有關，在未達到氨氮抑制濃度之前，更高的氨氮濃度會導致更高的甲烷含量[7]。發酵結束時單位VS 甲烷產量達到了0.815m3/kg，對 比 已 有 文 獻[25-26]報 道（0.490～0.737m3/kg、0.633m3/kg）的生活垃圾均處于領先水平。這與本次中試試驗采用的厭氧發酵設備有關，發酵罐為臥式厭氧發酵罐，罐內的攪拌裝置可以提供更加充分的攪拌效果，增強發酵罐內傳質效率，最終提高甲烷產量。

2.2 氨氮濃度變化分析

氨氮可用作細胞生長所需氮源，但過多的氨氮在發酵過程中積累會對甲烷合成產生抑制作用[27-29]。分析農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵過程中氨氮濃度變化，結合甲烷產生情況可以判斷發酵系統的穩定性。圖3為厭氧發酵過程中氨氮濃度變化。發酵過程氨氮濃度整體在4200～5200mg/L范圍內變化，氨氮濃度顯著高于已有報道厭氧發酵過程中的抑制閾值[30-31]。

圖3 氨氮濃度變化

而穩定于70%的甲烷含量和累積0.815m3/kg的甲烷產量說明發酵系統在高效運行，該氨氮濃度并未對系統產生抑制作用。本試驗發酵系統始終處于較高的氨氮環境中，其甲烷產量說明系統是具有高氨氮耐受能力的，產甲烷菌沒有因為高氨氮濃度而大量死亡，這可能與本次發酵所采用的優質接種物有關。接種物使用農村有機生活垃圾進行馴化后具有較強的氨氮耐受能力，較高的氨氮濃度為細菌生命活動提供充足的氮源，使得產甲烷菌始終保持較高的活性和數量，為生產甲烷提供堅實的基礎。

2.3 VFAs濃度變化分析

VFAs主要在厭氧發酵過程水解酸化階段產生，水解酸化階段產生更多的VFAs 說明對發酵底物的分解更加徹底，當VFAs 濃度超過發酵系統閾值后發酵系統失衡，產甲烷菌活性被抑制，系統發生酸化[32]。圖4為農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵過程中的VFAs濃度變化。圖中可以看出，發酵前10天VFAs 濃度處于上升階段，發酵主要處于快速水解和酸化階段，大量的有機物被細菌降解為VFAs。高濃度的VFAs 往往伴隨著酸化，本次試驗中甲烷含量和產量都處于較高的范圍內變化表明該濃度的VFAs并未對產甲烷菌產生脅迫作用。較高的VFAs濃度也說明對農村有機生活垃圾含有的難降解的纖維素類物質可能得到了更充分的降解，最終提高甲烷產量。達到峰值后VFAs 濃度開始下降，甲烷含量也快速趨于穩定，表明產甲烷菌在正常工作，將利用大量的VFAs生產甲烷。

圖4 VFAs濃度變化

2.4 微生物群落變化

厭氧發酵過程中3 個階段分別由特定的水解菌、產酸菌和產甲烷菌群介導，如果3個階段失衡則會出現嚴重的酸化和氨氮抑制等問題，最終導致無法正常產甲烷[33-34]。農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵中試各階段微生物群落組成變化如圖5所示。

圖5 微生物群落結構變化

古菌在屬水平上的群落結構顯示，干式厭氧發酵過程中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對豐度遠高于其他菌屬，在發酵的3個階段其相對豐度均超過80%。啟動階段Methanosarcina的絕對優勢地位說明馴化的接種物具有良好的產甲烷微生物環境，且為馴化過程中成長起來的適宜進行農村有機生活垃圾厭氧發酵的菌。運行階段和試驗結束時相對豐度仍超過80%，說明馴化的接種物完美適配農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵中試。

細菌的門分類水平顯示厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度3個階段均超過77%，最高為啟動階段的85.39%，試驗結束時為83.58%。發酵過程中出現了輕微波動，但在發酵系統中仍處于絕對優勢地位，可以保證有充足的細菌環境將有機物代謝成酸，供產甲烷菌利用生產甲烷。擬桿菌門（Bacteroidota）從啟動階段的3.87%增長至運行階段的13.44%，發酵過程中Firmicutes 相對豐度的輕微降低與Bacteroidota 的增長有關。Bacteroidota 可以分泌多種細胞外水解酶，將葡萄糖、淀粉等轉化為乙酸、丁酸、H2和CO2等[35]，同樣利于水解酸化階段的充分進行。

2.5 韋恩圖分析

韋恩圖可以直觀對比中試試驗過程中不同階段共有物種和獨有物種，古菌和細菌在OTU 水平的韋恩圖分別如圖6 所示。3 個時間段的古菌在OTU水平上有87.50%的菌是共有的，表明古菌在發酵過程中保持較高的相似性，較高的相似性表明發酵系統比較穩定，馴化的接種物發揮作用。啟動階段和運行階段有1種菌共有，試驗結束時有2種菌獨有。這表明發酵前后微生物群落結構穩定，沒有其他雜菌生長影響與產甲烷菌形成競爭關系，為厭氧發酵的高效進行提供保障。細菌在OTU水平3個階段共有核心物種占51.57%，相似性較古菌降低，這是由于在該水平下細菌物種較多，3個階段均超過了800，更多的物種帶來更多的差異性。古菌的多樣性則較低，3個階段為22～23。這可能是在高氨環境下造成的，能正常進行生命活動的古菌種類較少，但其適應了高氨環境，可以正常生產甲烷。發酵過程中3個階段的菌種類較接近，表明厭氧發酵系統內細菌群落穩定，厭氧發酵各階段功能菌群在適宜的環境發揮作用。

圖6 古菌和細菌在OTU水平韋恩圖

微生物群落分析表明，農村有機生活垃圾干式厭氧共發酵中試試驗中水解、酸化和產甲烷階段都有優勢菌存在，生長情況良好，Methanosarcina和Firmicutes 分別為古菌和細菌的絕對優勢菌。這為發酵生產甲烷提供了極佳的微生物環境，實現單位VS累積甲烷產量遠高于已有報道。

綜上，農村有機生活垃圾干式厭氧發酵中試試驗過程中產氣情況、VFAs 濃度、氨氮濃度和微生物變化情況表明，此次發酵試驗成功進行。發酵系統內部氨氮濃度處于高值，高于一般文獻所報道的產生抑制作用的閾值。在高氨環境中，發酵系統的甲烷體積分數在70%作用，且累積甲烷產量達到了新的高度。說明此次干式厭氧發酵試驗方案設計合理，通過共發酵，專用接種物馴化和傳質效率較高的太陽能發酵罐共同作用，使得發酵系統內微生物比較契合農村有機生活垃圾等高有機質含量原料。共發酵使得發酵系統具有更高的緩沖能力；接種物馴化使得細菌保障水解更徹底，為產甲烷提供更充分底物，產甲烷古菌具有更高的耐氨能力，在高氨環境中保持生命活動，持續利用前階段底物生產甲烷；傳質效率更高的發酵罐攪拌更充分，保證發酵底物與微生物接觸更加充分，防止局部酸化。以上方式共同保障發酵系統平穩運行。同時此次中試試驗持續130天，充分挖掘了農村有機生活垃圾的產氣潛力，這也解釋了其最終產氣量領先于已有研究。

3 結論

對農村有機生活垃圾進行了干式厭氧共發酵中試試驗，累積甲烷產量達到了0.815m3/kg，相較于已有文獻報道處于領先水平。發酵過程VFAs 濃度呈現先增長后降低的趨勢，氨氮濃度變化穩定，未出現酸化和氨氮抑制現象。微生物群落結構分析表明此次干式厭氧發酵中試系統的微生物生長環境良好，Methanosarcina和Firmicutes分別為古菌和細菌的絕對優勢菌群，發酵各階段達到了平衡。甲烷產量較高中試規模的干式厭氧發酵試驗為農村有機生活垃圾沼氣工程建設提供了有效的數據支持。