甲、乙型流感病毒檢測方法的研究進展

胡瑞，張艷亮，張娟

1.昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，云南昆明 650032；2.云南省檢驗醫學重點實驗室，云南昆明 650032；3.蒙自市中醫醫院檢驗科，云南蒙自 661199

流感（F1u）是由流感病毒（influenza virus）引起的急性發熱性呼吸道傳染病，主要經呼吸道飛沫傳播，臨床典型表現為突起畏寒、高熱、頭痛、全身酸痛、疲乏、食欲減退等，全身中毒癥狀明顯，而呼吸道癥狀較輕。具有潛伏期短、傳染性強、傳播速度快、發病率高等特點，通常還會并發較為嚴重的肺炎，更甚者還會致使患者出現腎、心臟等重要器官的衰竭，嚴重者還會致死，對公共衛生及人們身心健康帶來重大威脅。依據基質蛋白與核衣殼蛋白的同源性，一般將流感病毒分為3 種類型（甲、乙和丙）[1]。其中人類中最為流行的病毒主要為乙型流感病毒（influenza B virus, IB）和甲型流感病毒（influenza A virus, IA），而以上兩種病毒歸屬為正粘病毒科（onhomyxoviridae），為8 節段、單股負鏈RNA 病毒[2]。作為引起數次世界范圍較大流行的病毒，依據IA 表面的糖蛋白、神經氨酸酶（neuraminidase,NA）和血凝素（hemagglutinin, HA），可將IA 進一步化分為：H7N9、H3N2、H1N1、H5N1[3]。乙型流感病毒根據抗原特性和血凝素基因的核苷酸序列，可分為Yamagata 和Victoria 兩大譜系，乙型流感病毒的感染性和傳播能力較甲型弱且只感染人類，一般會引起局部流行。近年來世界各地都曾發生以甲型流感病毒或乙型流感病毒為主的流感流行[4]。因此，利用實驗室診斷方法快速、準確鑒別流感病毒至關重要，實現早診斷、早隔離、早治療。本文就目前常用的甲、乙型流感病毒病原學相關檢驗方法進行綜述，旨在為臨床提供快速準確的診斷依據。現綜述如下。

1 病毒分離培養

作為國際上較為常用的篩選流感疫苗株以及對流感病毒進行監測的一種實驗室方法，病毒分離培養法是目前流感監測研究中一種可靠的檢測手段[5]。病毒分離培養法具有敏感性高且精確度高等優點，在一定條件下可獲得更多、更全面的流感毒株信息情況，對后續了解流感病毒的耐藥性以及指導臨床制定科學有效的治療方案都具有十分重要的意義[6]。但也有一定局限性，如對操作要求高且繁瑣，細胞分離培養周期較長，實驗必須在BSL-2級及以上實驗室的生物安全柜內進行，存在一定安全隱患，不利于在流行期間做出快速診斷，故在基層醫院中不建議進行臨床推廣應用。

2 免疫學方法

對于流感病毒的檢測，免疫學方法屬于一種相對成熟的病毒檢測技術。常用的方法有膠體金法、免疫熒光法、流式細胞儀法、血清學檢測方法等。

2.1 膠體金法

作為臨床上較為普遍使用的一種標記技術，膠體金法是利用追蹤標志物（膠體金）與抗原抗體進行結合，從而達到免疫標記的一種新型技術，具有獨特的優點。近年已在各種生物醫學研究中廣泛使用。這也成為臨床免疫學研究的重點及熱點，受到臨床醫學科研界的廣泛關注[7]。膠體金免疫標記技術是現今臨床研究使用較多的一種檢測流感病毒的手段。在國內外已上市的流感病毒檢測產品中，流感抗原檢測試劑檢測的手段基本上都是依據快速免疫檢測原理而進行的免疫層析以及免疫滲濾等方法[8]。膠體金法是一種快速簡便的方法，可在15～30 min 內獲得檢測結果，具有不需特殊實驗設備、可用肉眼判定、試劑保存方便、穩定性和重復性好等優點，對于人群現場快速初篩定性，及時監控感染人群防止繼續傳播具有很大的優勢。當然其也有不足之處，如膠體金法定性試驗檢測準確度較低、假陽性率高、陰性不能排除病毒感染、難以進行質量控制等。

2.2 免疫熒光法

免疫熒光法主要是在熒光物質的幫助下對抗體進行標記，從而達到對抗原進行定位的目的，同時其進行標記的熒光色素對抗原抗體的活性沒有任何影響，其在抗體上通過與對應的抗原進行結合后會顯現出一種特異性的熒光反應。在李曉光等[9]的研究中對472 例患者采用免疫熒光法檢測，對乙型/甲型流感進行單獨或者聯合檢測，其檢測的特異度以及靈敏度均相對較高。Diallo D 等[10]應用Sofia 免疫熒光法對238 例兒科急診患兒進行甲、乙型流感病毒檢測，結果為陽性組得到明確診斷，故住院率明顯降低。免疫熒光法幫助患者機體內部組織中的病毒抗原與抗病毒抗體（標有熒光素）進行相應的結合，具有高度的特異性以及敏感性，對流感患者明確診斷，指導治療，改善預后均有重要意義，是目前很多基層醫院實驗室流感病毒檢測的主流方法[11]。但是該種方法的操作步驟相對復雜，且對結果進行判斷時有較大主觀性，因此假陽性的概率相對較高，無法滿足臨床檢測所需要的高效、快速等要求。

2.3 流式細胞儀法

流式細胞儀法檢測甲、乙型流感病毒抗原是運用待測抗原與熒光素標記抗體特異性反應，將懸浮細胞染色和流式細胞儀計數原理相結合。劉冬蘭等[12]采用流式細胞儀及直接熒光素標記抗體以檢測甲、乙型流測病毒抗原，針對157 份鼻咽拭子標本，兩種檢測方法的結果一致性較好。應用流式細胞儀法檢測能夠實現高通量檢測，不僅結果準確可靠、操作簡便，而且檢測速度相對較快，其一般同時進行篩查和鑒定兩項工作，并在2 h 內提供結果，故臨床檢測的應用價值相對較高。但需用專用儀器，標本陳舊、運輸或保存不當等可致抗原降解出現假陰性結果。

2.4 血清學檢測方法

人體內部一但感染病毒后，病毒就會在人的機體內產生對應的病毒特異性抗體，而且由于在患者感染流感病毒（甲型、乙型）后，潛伏期相對較短，故大多數情況下患者血清中的抗體都是在病程后或者結束期才得以被檢測出，且對于急性期的患者血清，在其處于恢復階段，其機體內部血清會造成某種類型的流感病毒的中和抗體滴度呈現出4 倍及以上升高的趨勢，從而對患者是否感染了以上亞型的流感病毒進行確診。而血清學的檢測方法對甲、乙型流感病毒檢驗的特異度相對較高，同時該種檢測方法在對疫情的監控、鑒別流感的分型等流行病學的相關研究以及對于疫苗的評估都擁有相對舉足輕重的作用。但是在進行檢測實驗時，往往需要對患者急性期和恢復期的血液分別進行采集，且進行實驗的周期相對較長，同時擁有較多的干擾因素，因此不建議作為早期對病毒進行快速診斷的方法。

3 病毒核酸檢測方法

近幾年，病毒核酸檢測技術已被越來越廣泛地應用于診斷病原體的檢測中，對甲、乙型流感病毒核酸進行檢測的技術，主要是通過在核酸擴增的幫助下對病毒進行檢測，且其對于病毒檢測以及診斷的特異性、靈敏度相較于其他檢測方法更高。

3.1 聚合酶鏈反應

作為一種能夠在體外擴增特定DNA 片段的分子生物學技術，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）具有敏感性、特異性高等優點，可在較短時間內對流感病毒進行檢測，對早期診斷流感病毒感染具有較高價值[13]。目前，對甲、乙型流感病毒核酸進行檢測的PCR 法，大多數采用實時熒光聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）法和常規逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法。其中常規RT-PCR 能夠對標本中的流感病毒核酸展開檢驗，此外，其還能夠通過將擴增產物測序后，對序列進行分析，從而依據系統分析對病毒的對應亞型進行判斷，但是常規RT-PCR 需要進行開放式電泳的相關步驟，因此容易對樣本造成交叉污染。而實時熒光RT-PCR 通過將Taqman 與RT-PCR 技術進行結合，在熒光標記物的幫助下采用相對較為封閉的檢測，同時還能夠將樣本中的病毒載量進行相關的定量分析[14]，通常情況下不用對PCR 的產物在整個進行檢測的過程進行下一步的處理，所以該種檢測的整體檢測時間就相對較短，具有較高的檢測效率，同時其假陽性的發生率以及檢測中的感染率均相對較低；且其主要通過應用特異性探針的方法對非特異性擴增的情況進行檢測，因此與常規RT-PCR 進行對比，該種方法擁有相對較為簡單的操作過程，且特異度以及靈敏度均相對較強，還可達到高通量檢測的目的[15]。該種方法是預防甲、乙型流感疫情暴發流行的關鍵環節，能夠消減傳染高峰、延緩傳播速度。

3.2 恒溫核酸擴增技術

恒溫核酸擴增技術是利用各種酶、引物、核苷酸、模板核酸以及緩沖液的混合物在同一溫度下溫浴一定時間，讓不同的酶與核酸進行反應，從而達到特定核酸片段的快速擴增目的。與傳統的PCR核酸擴增相比，恒溫核酸擴增不需要在不同溫度之間的轉換，只要保持酶反應的最佳溫度即可。需要使用的設備比較簡單，可以將檢測成本大大降低，從而有效地提高現場檢測的效率，縮短現場檢測所需要的時間[16]。該檢測方法的建立，對甲、乙型流感病毒的臨床快速診斷和預防控制具有重要的意義，恒溫核酸擴增技術在季節性高流行期間有望取代傳統PCR 診斷技術[17]。目前檢測甲、乙型流病毒較常用的恒溫擴增法有重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification, RPA）、依賴核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、環介導的等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等。

3.2.1 LAMP 技術 LAMP 技術主要是對靶序列特異位置的引物、BstDNA 聚合酶及擁有的鏈置換活性進行識別，在等溫條件時，其能夠自動循環進行鏈置換核酸擴增反應，在反應期間，能夠產生肉眼可見的白色沉淀。而該種檢測的操作方法相對簡單，且處于等溫的環境中就能夠發生核酸的擴增以及變性，無需其他儀器設備進行輔助，僅需要肉眼即可對檢測結果進行判定；該種方法具有高效率且擴增快速的特點，不需要預先雙鏈DNA 熱變性，并且短時間內擴增指數可達109以上；該種方法具有較高的檢測特異性，其對6～8 個靶序列區域設計的4～6條特異性引物，任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增。RT-LAMP 技術是一步核酸擴增技術，采用LAMP 和逆轉錄酶進行病毒RNA 檢測。與RT-PCR 一樣，RT-LAMP 使用逆轉錄酶從RNA 制備互補DNA，并通過使用DNA 聚合酶進一步擴增。這在用RNA 基因組檢測病毒方面非常有效。崔淑娟等[18]的研究中指出，在對甲型流感病毒的檢測中，RT-LAMP 方法靈敏度較高（檢測限下限：50 拷貝/ul），且對比該種方法與實時熒光PCR 檢測后可發現，該種方法更適用于在現場或者基層進行相對較快的檢測。但LAMP 技術只能定性，引物設計難度高，操作過程中極易受到污染而至假陽性結果。3.2.2 RPA 技術 作為一種較為新型的核酸等溫擴增技術，RPA 技術是在鏈置換DNA 聚合酶、單鏈DNA結合蛋白（single strand DNA-binding protein, SSB）以及能結合寡核苷酸引物的重組酶的幫助下完成檢測。以上各種酶的混合物需要在37℃的環境下才可進行反應。引物通過蛋白-DNA 復合物（重組酶與引物結合的產物）的幫助，可以對同源序列的位置進行確定，并于確定后生成鏈交換反應，并于以上物質生成的同時啟動DNA 的合成，并采取指數式的方式對模板上的目標區域進行擴增[19]。以上被替換的DNA 鏈為了防止出現進一步的替換，則會和SSB 進行結合。且因為該種方法所需要的反應環境溫度相對較低，僅需保持溫度在25～42℃，且反應的速度相對較快(＜1 h)，檢測的靈敏度較高，因此可以廣泛應用于臨床病原微生物核酸的快速檢測上。在對探針、RPA 引物進行設計時，只需要一個探針以及一對引物即可幫助熒光檢測的反應體系對目標基因進行擴增，還可在整個擴增過程中對擴增進展進行實時的監控[20]。截止目前，普遍認為PCR 核酸檢測技術能夠被RPA 技術取代，但受技術制約，其仍存在不足，如擴增體系中含有大量蛋白質、PEG 等成分，造成RPA 產物檢測困難；沒有PCR 的熱循環來避免引物之間的結合，故恒定溫度下反應難以避免部分非特異性擴增。

3.2.3 NASBA 技術 NASBA 技術是一項在PCR 基礎上發展起來的以RNA 為模板的快速等溫擴增并能實時監測結果的檢測方法，在恒定的溫度條件下即可直接擴增單鏈RNA。該種方法的反應主要是在噬菌體T7RNA 多聚酶、核糖核酸酶H、AMV 逆轉錄酶以及兩種特殊的寡核苷酸引物的幫助下識別其中一個引物（5’端帶有T7RNA 聚合酶）的啟動子序列，而檢測另一引物（5’端擁有和標記電化學）的探針互補序列，借助光電信號輔助，完成流感病毒的RNA 相關定性、定量研究[21]。NASBA 技術屬于一種高通量的檢測方法，需要反應的條件相對較為溫和，且具有全封閉式反應的特點，能有效避免污染物，且在同時篩查多個樣本時，具有一定的優勢，可通過使用不同熒光基團對分子信標進行標記，同時在同一個反應中進行擴增并對不同的目標RNA 擴增情況進行實時的監測[22]。雖然該種檢測方法出現假陰性、假陽性的可能性也不小，但隨著便攜式NASBA 檢測儀的面市，使用該技術更適于現場快速診斷，對于季節性甲、乙型流感病毒快速篩查具有一定的優勢。

3.3 液相基因芯片技術

液相基因芯片技術的主要原理依據為流式細胞儀、熒光染料編碼的微球。在各個種類的微球上都偶聯著具有一定針對性的探針（含有核苷酸片段），且對以上探針以及特異性引物的雙重設計可以保證該種方法進行檢測的特異性。作為一種相對新型的檢測技術，液相基因芯片主要是在多標志物的幫助下對檢測通量進行檢測[23]。在陳錦龍等[24]的研究中，設計了特異性引物以及探針（甲、乙型流感病毒M 基因的核苷酸序列），且在甲、乙型流感病毒的分型鑒別中，具有相對較高的特異性和重復性。且液相基因芯片主要是通過核酸分子的雜交對流感病毒進行相關分型，并以探針和PCR 產物之間的互補作為進行檢測的基礎，因此擁有相對較高的檢測準確性[25]。近年來，多重熒光RT-PCR 方法被普遍應用于實驗室流行病毒分型研究中，且目前多應用于鑒別甲型、乙型流病毒分型。液相基因芯片技術主要通過將兩種方法進行結合（多重PCR技術、液相基因芯片技術），可以有效克服設計難度高的多重熒光檢測方法的弊端，并可以同時對兩種類型的流感病毒的分型進行檢測，有利于流感病毒的快速鑒定和診斷。

4 小結與展望

甲、乙型流感是分布于全球的感染性疾病，在歷史上已經出現過較多的大流行以及爆發流行，對人類身心健康具有較為直接的危害，也給國家經濟發展及社會穩定造成一定威脅，故尋求安全可靠的甲、乙型流感病毒檢測方式成為臨床研究重點[26]。近年來，臨床上對于檢測甲、乙型流感病毒的技術隨著時間的發展也在不斷地進步，且隨著多種商品化試劑盒以及新的診斷技術的不斷涌現。依據抗原以及核酸進行快速檢測的方法由于具有準確而快速的特點，在臨床上對于乙型、甲型流感的檢測診斷中發揮著舉足輕重的作用。然而，對于傳統的病毒進行對應分離以及培養是現今臨床的研究重點，同時其擁有便宜且容易對新毒株進行檢測的優點。而血清學方法檢測需要等體內病毒水平蓄積到一定程度才可發現，雖然其檢測診斷的速度較慢且無法早期進行診斷，但仍然可以用于甲、乙型流感流行病學的相關調查以及對應的疫苗評估。因此，在甲、乙型流感預防控制的不同環節，可根據診斷技術的各自特點和公共衛生的需要，結合不同地區對流感病毒檢測的要求，對檢測設備以及方法進行合適的選擇，是提高診斷效率的重點。由于臨床上流感病毒（甲、乙型）對應藥物的耐藥性的不斷增加，且該類病毒的基因組也在不斷變異，因此現今的診斷技術仍需不斷的進步，以便于克服將來可能面對的巨大挑戰。