甲、乙型流感病毒檢測方法的研究進展

胡瑞，張艷亮，張娟

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，云南昆明 650032；2.云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，云南昆明 650032；3.蒙自市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，云南蒙自 661199

流感（F1u）是由流感病毒（influenza virus）引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，主要經(jīng)呼吸道飛沫傳播，臨床典型表現(xiàn)為突起畏寒、高熱、頭痛、全身酸痛、疲乏、食欲減退等，全身中毒癥狀明顯，而呼吸道癥狀較輕。具有潛伏期短、傳染性強、傳播速度快、發(fā)病率高等特點，通常還會并發(fā)較為嚴重的肺炎，更甚者還會致使患者出現(xiàn)腎、心臟等重要器官的衰竭，嚴重者還會致死，對公共衛(wèi)生及人們身心健康帶來重大威脅。依據(jù)基質(zhì)蛋白與核衣殼蛋白的同源性，一般將流感病毒分為3 種類型（甲、乙和丙）[1]。其中人類中最為流行的病毒主要為乙型流感病毒（influenza B virus, IB）和甲型流感病毒（influenza A virus, IA），而以上兩種病毒歸屬為正粘病毒科（onhomyxoviridae），為8 節(jié)段、單股負鏈RNA 病毒[2]。作為引起數(shù)次世界范圍較大流行的病毒，依據(jù)IA 表面的糖蛋白、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,NA）和血凝素（hemagglutinin, HA），可將IA 進一步化分為：H7N9、H3N2、H1N1、H5N1[3]。乙型流感病毒根據(jù)抗原特性和血凝素基因的核苷酸序列，可分為Yamagata 和Victoria 兩大譜系，乙型流感病毒的感染性和傳播能力較甲型弱且只感染人類，一般會引起局部流行。近年來世界各地都曾發(fā)生以甲型流感病毒或乙型流感病毒為主的流感流行[4]。因此，利用實驗室診斷方法快速、準確鑒別流感病毒至關(guān)重要，實現(xiàn)早診斷、早隔離、早治療。本文就目前常用的甲、乙型流感病毒病原學(xué)相關(guān)檢驗方法進行綜述，旨在為臨床提供快速準確的診斷依據(jù)。現(xiàn)綜述如下。

1 病毒分離培養(yǎng)

作為國際上較為常用的篩選流感疫苗株以及對流感病毒進行監(jiān)測的一種實驗室方法，病毒分離培養(yǎng)法是目前流感監(jiān)測研究中一種可靠的檢測手段[5]。病毒分離培養(yǎng)法具有敏感性高且精確度高等優(yōu)點，在一定條件下可獲得更多、更全面的流感毒株信息情況，對后續(xù)了解流感病毒的耐藥性以及指導(dǎo)臨床制定科學(xué)有效的治療方案都具有十分重要的意義[6]。但也有一定局限性，如對操作要求高且繁瑣，細胞分離培養(yǎng)周期較長，實驗必須在BSL-2級及以上實驗室的生物安全柜內(nèi)進行，存在一定安全隱患，不利于在流行期間做出快速診斷，故在基層醫(yī)院中不建議進行臨床推廣應(yīng)用。

2 免疫學(xué)方法

對于流感病毒的檢測，免疫學(xué)方法屬于一種相對成熟的病毒檢測技術(shù)。常用的方法有膠體金法、免疫熒光法、流式細胞儀法、血清學(xué)檢測方法等。

2.1 膠體金法

作為臨床上較為普遍使用的一種標記技術(shù)，膠體金法是利用追蹤標志物（膠體金）與抗原抗體進行結(jié)合，從而達到免疫標記的一種新型技術(shù)，具有獨特的優(yōu)點。近年已在各種生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用。這也成為臨床免疫學(xué)研究的重點及熱點，受到臨床醫(yī)學(xué)科研界的廣泛關(guān)注[7]。膠體金免疫標記技術(shù)是現(xiàn)今臨床研究使用較多的一種檢測流感病毒的手段。在國內(nèi)外已上市的流感病毒檢測產(chǎn)品中，流感抗原檢測試劑檢測的手段基本上都是依據(jù)快速免疫檢測原理而進行的免疫層析以及免疫滲濾等方法[8]。膠體金法是一種快速簡便的方法，可在15～30 min 內(nèi)獲得檢測結(jié)果，具有不需特殊實驗設(shè)備、可用肉眼判定、試劑保存方便、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點，對于人群現(xiàn)場快速初篩定性，及時監(jiān)控感染人群防止繼續(xù)傳播具有很大的優(yōu)勢。當然其也有不足之處，如膠體金法定性試驗檢測準確度較低、假陽性率高、陰性不能排除病毒感染、難以進行質(zhì)量控制等。

2.2 免疫熒光法

免疫熒光法主要是在熒光物質(zhì)的幫助下對抗體進行標記，從而達到對抗原進行定位的目的，同時其進行標記的熒光色素對抗原抗體的活性沒有任何影響，其在抗體上通過與對應(yīng)的抗原進行結(jié)合后會顯現(xiàn)出一種特異性的熒光反應(yīng)。在李曉光等[9]的研究中對472 例患者采用免疫熒光法檢測，對乙型/甲型流感進行單獨或者聯(lián)合檢測，其檢測的特異度以及靈敏度均相對較高。Diallo D 等[10]應(yīng)用Sofia 免疫熒光法對238 例兒科急診患兒進行甲、乙型流感病毒檢測，結(jié)果為陽性組得到明確診斷，故住院率明顯降低。免疫熒光法幫助患者機體內(nèi)部組織中的病毒抗原與抗病毒抗體（標有熒光素）進行相應(yīng)的結(jié)合，具有高度的特異性以及敏感性，對流感患者明確診斷，指導(dǎo)治療，改善預(yù)后均有重要意義，是目前很多基層醫(yī)院實驗室流感病毒檢測的主流方法[11]。但是該種方法的操作步驟相對復(fù)雜，且對結(jié)果進行判斷時有較大主觀性，因此假陽性的概率相對較高，無法滿足臨床檢測所需要的高效、快速等要求。

2.3 流式細胞儀法

流式細胞儀法檢測甲、乙型流感病毒抗原是運用待測抗原與熒光素標記抗體特異性反應(yīng)，將懸浮細胞染色和流式細胞儀計數(shù)原理相結(jié)合。劉冬蘭等[12]采用流式細胞儀及直接熒光素標記抗體以檢測甲、乙型流測病毒抗原，針對157 份鼻咽拭子標本，兩種檢測方法的結(jié)果一致性較好。應(yīng)用流式細胞儀法檢測能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測，不僅結(jié)果準確可靠、操作簡便，而且檢測速度相對較快，其一般同時進行篩查和鑒定兩項工作，并在2 h 內(nèi)提供結(jié)果，故臨床檢測的應(yīng)用價值相對較高。但需用專用儀器，標本陳舊、運輸或保存不當?shù)瓤芍驴乖到獬霈F(xiàn)假陰性結(jié)果。

2.4 血清學(xué)檢測方法

人體內(nèi)部一但感染病毒后，病毒就會在人的機體內(nèi)產(chǎn)生對應(yīng)的病毒特異性抗體，而且由于在患者感染流感病毒（甲型、乙型）后，潛伏期相對較短，故大多數(shù)情況下患者血清中的抗體都是在病程后或者結(jié)束期才得以被檢測出，且對于急性期的患者血清，在其處于恢復(fù)階段，其機體內(nèi)部血清會造成某種類型的流感病毒的中和抗體滴度呈現(xiàn)出4 倍及以上升高的趨勢，從而對患者是否感染了以上亞型的流感病毒進行確診。而血清學(xué)的檢測方法對甲、乙型流感病毒檢驗的特異度相對較高，同時該種檢測方法在對疫情的監(jiān)控、鑒別流感的分型等流行病學(xué)的相關(guān)研究以及對于疫苗的評估都擁有相對舉足輕重的作用。但是在進行檢測實驗時，往往需要對患者急性期和恢復(fù)期的血液分別進行采集，且進行實驗的周期相對較長，同時擁有較多的干擾因素，因此不建議作為早期對病毒進行快速診斷的方法。

3 病毒核酸檢測方法

近幾年，病毒核酸檢測技術(shù)已被越來越廣泛地應(yīng)用于診斷病原體的檢測中，對甲、乙型流感病毒核酸進行檢測的技術(shù)，主要是通過在核酸擴增的幫助下對病毒進行檢測，且其對于病毒檢測以及診斷的特異性、靈敏度相較于其他檢測方法更高。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)

作為一種能夠在體外擴增特定DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）具有敏感性、特異性高等優(yōu)點，可在較短時間內(nèi)對流感病毒進行檢測，對早期診斷流感病毒感染具有較高價值[13]。目前，對甲、乙型流感病毒核酸進行檢測的PCR 法，大多數(shù)采用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）法和常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法。其中常規(guī)RT-PCR 能夠?qū)吮局械牧鞲胁《竞怂嵴归_檢驗，此外，其還能夠通過將擴增產(chǎn)物測序后，對序列進行分析，從而依據(jù)系統(tǒng)分析對病毒的對應(yīng)亞型進行判斷，但是常規(guī)RT-PCR 需要進行開放式電泳的相關(guān)步驟，因此容易對樣本造成交叉污染。而實時熒光RT-PCR 通過將Taqman 與RT-PCR 技術(shù)進行結(jié)合，在熒光標記物的幫助下采用相對較為封閉的檢測，同時還能夠?qū)颖局械牟《据d量進行相關(guān)的定量分析[14]，通常情況下不用對PCR 的產(chǎn)物在整個進行檢測的過程進行下一步的處理，所以該種檢測的整體檢測時間就相對較短，具有較高的檢測效率，同時其假陽性的發(fā)生率以及檢測中的感染率均相對較低；且其主要通過應(yīng)用特異性探針的方法對非特異性擴增的情況進行檢測，因此與常規(guī)RT-PCR 進行對比，該種方法擁有相對較為簡單的操作過程，且特異度以及靈敏度均相對較強，還可達到高通量檢測的目的[15]。該種方法是預(yù)防甲、乙型流感疫情暴發(fā)流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠消減傳染高峰、延緩傳播速度。

3.2 恒溫核酸擴增技術(shù)

恒溫核酸擴增技術(shù)是利用各種酶、引物、核苷酸、模板核酸以及緩沖液的混合物在同一溫度下溫浴一定時間，讓不同的酶與核酸進行反應(yīng)，從而達到特定核酸片段的快速擴增目的。與傳統(tǒng)的PCR核酸擴增相比，恒溫核酸擴增不需要在不同溫度之間的轉(zhuǎn)換，只要保持酶反應(yīng)的最佳溫度即可。需要使用的設(shè)備比較簡單，可以將檢測成本大大降低，從而有效地提高現(xiàn)場檢測的效率，縮短現(xiàn)場檢測所需要的時間[16]。該檢測方法的建立，對甲、乙型流感病毒的臨床快速診斷和預(yù)防控制具有重要的意義，恒溫核酸擴增技術(shù)在季節(jié)性高流行期間有望取代傳統(tǒng)PCR 診斷技術(shù)[17]。目前檢測甲、乙型流病毒較常用的恒溫擴增法有重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification, RPA）、依賴核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等。

3.2.1 LAMP 技術(shù) LAMP 技術(shù)主要是對靶序列特異位置的引物、BstDNA 聚合酶及擁有的鏈置換活性進行識別，在等溫條件時，其能夠自動循環(huán)進行鏈置換核酸擴增反應(yīng)，在反應(yīng)期間，能夠產(chǎn)生肉眼可見的白色沉淀。而該種檢測的操作方法相對簡單，且處于等溫的環(huán)境中就能夠發(fā)生核酸的擴增以及變性，無需其他儀器設(shè)備進行輔助，僅需要肉眼即可對檢測結(jié)果進行判定；該種方法具有高效率且擴增快速的特點，不需要預(yù)先雙鏈DNA 熱變性，并且短時間內(nèi)擴增指數(shù)可達109以上；該種方法具有較高的檢測特異性，其對6～8 個靶序列區(qū)域設(shè)計的4～6條特異性引物，任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增。RT-LAMP 技術(shù)是一步核酸擴增技術(shù)，采用LAMP 和逆轉(zhuǎn)錄酶進行病毒RNA 檢測。與RT-PCR 一樣，RT-LAMP 使用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA 制備互補DNA，并通過使用DNA 聚合酶進一步擴增。這在用RNA 基因組檢測病毒方面非常有效。崔淑娟等[18]的研究中指出，在對甲型流感病毒的檢測中，RT-LAMP 方法靈敏度較高（檢測限下限：50 拷貝/ul），且對比該種方法與實時熒光PCR 檢測后可發(fā)現(xiàn)，該種方法更適用于在現(xiàn)場或者基層進行相對較快的檢測。但LAMP 技術(shù)只能定性，引物設(shè)計難度高，操作過程中極易受到污染而至假陽性結(jié)果。3.2.2 RPA 技術(shù) 作為一種較為新型的核酸等溫擴增技術(shù)，RPA 技術(shù)是在鏈置換DNA 聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein, SSB）以及能結(jié)合寡核苷酸引物的重組酶的幫助下完成檢測。以上各種酶的混合物需要在37℃的環(huán)境下才可進行反應(yīng)。引物通過蛋白-DNA 復(fù)合物（重組酶與引物結(jié)合的產(chǎn)物）的幫助，可以對同源序列的位置進行確定，并于確定后生成鏈交換反應(yīng)，并于以上物質(zhì)生成的同時啟動DNA 的合成，并采取指數(shù)式的方式對模板上的目標區(qū)域進行擴增[19]。以上被替換的DNA 鏈為了防止出現(xiàn)進一步的替換，則會和SSB 進行結(jié)合。且因為該種方法所需要的反應(yīng)環(huán)境溫度相對較低，僅需保持溫度在25～42℃，且反應(yīng)的速度相對較快(＜1 h)，檢測的靈敏度較高，因此可以廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物核酸的快速檢測上。在對探針、RPA 引物進行設(shè)計時，只需要一個探針以及一對引物即可幫助熒光檢測的反應(yīng)體系對目標基因進行擴增，還可在整個擴增過程中對擴增進展進行實時的監(jiān)控[20]。截止目前，普遍認為PCR 核酸檢測技術(shù)能夠被RPA 技術(shù)取代，但受技術(shù)制約，其仍存在不足，如擴增體系中含有大量蛋白質(zhì)、PEG 等成分，造成RPA 產(chǎn)物檢測困難；沒有PCR 的熱循環(huán)來避免引物之間的結(jié)合，故恒定溫度下反應(yīng)難以避免部分非特異性擴增。

3.2.3 NASBA 技術(shù) NASBA 技術(shù)是一項在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的以RNA 為模板的快速等溫擴增并能實時監(jiān)測結(jié)果的檢測方法，在恒定的溫度條件下即可直接擴增單鏈RNA。該種方法的反應(yīng)主要是在噬菌體T7RNA 多聚酶、核糖核酸酶H、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶以及兩種特殊的寡核苷酸引物的幫助下識別其中一個引物（5’端帶有T7RNA 聚合酶）的啟動子序列，而檢測另一引物（5’端擁有和標記電化學(xué)）的探針互補序列，借助光電信號輔助，完成流感病毒的RNA 相關(guān)定性、定量研究[21]。NASBA 技術(shù)屬于一種高通量的檢測方法，需要反應(yīng)的條件相對較為溫和，且具有全封閉式反應(yīng)的特點，能有效避免污染物，且在同時篩查多個樣本時，具有一定的優(yōu)勢，可通過使用不同熒光基團對分子信標進行標記，同時在同一個反應(yīng)中進行擴增并對不同的目標RNA 擴增情況進行實時的監(jiān)測[22]。雖然該種檢測方法出現(xiàn)假陰性、假陽性的可能性也不小，但隨著便攜式NASBA 檢測儀的面市，使用該技術(shù)更適于現(xiàn)場快速診斷，對于季節(jié)性甲、乙型流感病毒快速篩查具有一定的優(yōu)勢。

3.3 液相基因芯片技術(shù)

液相基因芯片技術(shù)的主要原理依據(jù)為流式細胞儀、熒光染料編碼的微球。在各個種類的微球上都偶聯(lián)著具有一定針對性的探針（含有核苷酸片段），且對以上探針以及特異性引物的雙重設(shè)計可以保證該種方法進行檢測的特異性。作為一種相對新型的檢測技術(shù)，液相基因芯片主要是在多標志物的幫助下對檢測通量進行檢測[23]。在陳錦龍等[24]的研究中，設(shè)計了特異性引物以及探針（甲、乙型流感病毒M 基因的核苷酸序列），且在甲、乙型流感病毒的分型鑒別中，具有相對較高的特異性和重復(fù)性。且液相基因芯片主要是通過核酸分子的雜交對流感病毒進行相關(guān)分型，并以探針和PCR 產(chǎn)物之間的互補作為進行檢測的基礎(chǔ)，因此擁有相對較高的檢測準確性[25]。近年來，多重?zé)晒釸T-PCR 方法被普遍應(yīng)用于實驗室流行病毒分型研究中，且目前多應(yīng)用于鑒別甲型、乙型流病毒分型。液相基因芯片技術(shù)主要通過將兩種方法進行結(jié)合（多重PCR技術(shù)、液相基因芯片技術(shù)），可以有效克服設(shè)計難度高的多重?zé)晒鈾z測方法的弊端，并可以同時對兩種類型的流感病毒的分型進行檢測，有利于流感病毒的快速鑒定和診斷。

4 小結(jié)與展望

甲、乙型流感是分布于全球的感染性疾病，在歷史上已經(jīng)出現(xiàn)過較多的大流行以及爆發(fā)流行，對人類身心健康具有較為直接的危害，也給國家經(jīng)濟發(fā)展及社會穩(wěn)定造成一定威脅，故尋求安全可靠的甲、乙型流感病毒檢測方式成為臨床研究重點[26]。近年來，臨床上對于檢測甲、乙型流感病毒的技術(shù)隨著時間的發(fā)展也在不斷地進步，且隨著多種商品化試劑盒以及新的診斷技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。依據(jù)抗原以及核酸進行快速檢測的方法由于具有準確而快速的特點，在臨床上對于乙型、甲型流感的檢測診斷中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，對于傳統(tǒng)的病毒進行對應(yīng)分離以及培養(yǎng)是現(xiàn)今臨床的研究重點，同時其擁有便宜且容易對新毒株進行檢測的優(yōu)點。而血清學(xué)方法檢測需要等體內(nèi)病毒水平蓄積到一定程度才可發(fā)現(xiàn)，雖然其檢測診斷的速度較慢且無法早期進行診斷，但仍然可以用于甲、乙型流感流行病學(xué)的相關(guān)調(diào)查以及對應(yīng)的疫苗評估。因此，在甲、乙型流感預(yù)防控制的不同環(huán)節(jié)，可根據(jù)診斷技術(shù)的各自特點和公共衛(wèi)生的需要，結(jié)合不同地區(qū)對流感病毒檢測的要求，對檢測設(shè)備以及方法進行合適的選擇，是提高診斷效率的重點。由于臨床上流感病毒（甲、乙型）對應(yīng)藥物的耐藥性的不斷增加，且該類病毒的基因組也在不斷變異，因此現(xiàn)今的診斷技術(shù)仍需不斷的進步，以便于克服將來可能面對的巨大挑戰(zhàn)。