云南黑松露脂肪酶酶學性質研究及應用

王琪 高厚基 瞿靜 謝政澤 吳春霞 陳韜

摘要：為拓寬云南黑松露的應用范圍，采用雙水相萃取法、殼聚糖沉淀法和雙水相-殼聚糖沉淀結合法對云南黑松露脂肪酶進行純化，確定最佳純化方法，并研究脂肪酶的酶學特性、酶動力學及在中式香腸中的應用。結果表明，雙水相-殼聚糖沉淀結合法純化效果最好，酶比活力達到最高42.98 U/mg。黑松露脂肪酶最適溫度為50 ℃，最適pH值為5，Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。將黑松露經過完全滅酶（CK組）和不滅酶（HT組）處理后添加在中式香腸中，HT組新增花生四烯酸、月桂酸、二十一烷酸，且4種飽和脂肪酸、4種單不飽和脂肪酸和3種多不飽和脂肪酸的含量顯著提高（P＜0.05）。HT組的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的總含量均約為CK組的2倍。綜上，在中式香腸中添加云南黑松露，可以促進脂質水解，從而增加中式香腸中優質脂肪酸和風味前體物質的含量。

關鍵詞：黑松露；脂肪酶；酶學特性；游離脂肪酸

中圖分類號：TS201.25????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0033-06

Study on Enzymatic Properties of Yunnan Tuber melanosporum Lipase and Its Application

WANG Qi1，2，3， GAO Hou-ji2， QU Jing1，4， XIE Zheng-ze1， WU Chun-xia1， CHEN Tao1*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.Kunming Gaoshanggao Food Co.， Ltd.， Kunming 650100， China; 3.School of

Wuliangye Technology and Food Engineering， Yibin Vocational and Technical College，

Yibin 644003， China; 4.Scientific and Technological Information Division， Chuxiong

Medical College， Chuxiong 675000， China）

Abstract： In order to broaden the application scope of Yunnan Tuber melanosporum， Yunnan Tuber melanosporum lipase is purified by aqueous two-phase extraction， chitosan precipitation and combination of aqueous two-phase extraction and chitosan precipitation to determine the best purification method. Meanwhile， the enzymatic properties， enzyme kinetics and application of lipase in Chinese sausages are studied. The results show that purification effect of the combination of aqueous two-phase extraction and chitosan precipitation is the best， with the highest enzyme specific activity of 42.98 U/mg. The optimum temperature of Tuber melanosporum lipase is 50 ℃， the optimum pH value is 5， Km=33.33 mol/L， and Vmax=1.91 mol/（L·min）. When Tuber melanosporum is added into Chinese sausages after complete inactivated enzyme （CK group） and non-inactivated enzyme （HT group）， arachidonic acid， lauric acid and heneicosan oic acid appear in HT group， and the content of four saturated fatty acids， four monounsaturated fatty acids and three polyunsaturated fatty acids increases significantly （P<0.05）. The total content of saturated， monounsaturated and polyunsaturated fatty acids in HT group is all about twice as much as that in CK group. In conclusion， it can be seen that the addition of Yunnan Tuber

melanosporum into Chinese sausages can promote lipolysis， thus increasing the content of high-quality fatty acids and flavor precursors in Chinese sausages.

Key words： Tuber melanosporum; lipase; enzymatic properties; free fatty acid

收稿日期：2023-02-19

基金項目：云南農業大學科研發展基金項目（KX900127000）；云南農業大學第十五屆學生創新創業行動基金項目（2022ZKY349）

作者簡介：王琪（1989－），女，副教授，博士研究生，研究方向：肉品質控制和畜產品加工。

通信作者：陳韜（1963－），男，教授，博士，研究方向：肉品質控制和畜產品加工。

黑松露（Tuber melanosporum），又稱黑塊菌，在我國山林地區俗稱“豬拱菌”、“無娘藤”、“土菇”、“松毛茯苓”，是一類地下生子囊菌門真菌[1]，子囊果實以暗色為主，且表面有明顯的瘤突，主要分布在云南、四川等西南地區，最近在北方地區也有發現[2-3]。云南黑松露資源豐富且營養價值高[4-6]，富含多糖[7]、α-雄烷醇（α-androstanol，即5α-雄甾-16-烯-3α-醇）[8]、鞘脂[9]、甾醇[10]等多種生物活性物質，具有提高免疫力、抗炎癥、抗腫瘤等藥用價值[11-14]。目前，國內學者對黑松露的研究主要集中在培育、生物活性物質的提取等方面，而對黑松露其他方面的研究與開發還遠遠不夠。

中式香腸是深受人們喜愛的傳統特色肉制品。目前中式香腸加工中主要采用烘烤方式進行干燥，因為加工時間短，所以風味欠佳。因此，企業在生產中通過添加少量的黑松露來改善香腸的風味，但是黑松露能改善中式香腸風味的原因并不清楚。Martin等[15]研究表明黑松露中含有較多編碼脂肪酶的基因，Wu等[16]的研究也表明黑松露提取物可以使糖尿病小鼠的脂肪酶含量提高，從而促進脂質的代謝，說明黑松露中富含脂肪酶。脂肪酶（lipase），又稱三酰基甘油三酯酰水解酶，是一類在親水親脂界面分解和合成甘油三酯的酶，是一種重要的生物和工業用酶，廣泛應用于食品加工[17-18]、油脂加工[19]、化妝品、制藥[20]等行業。脂質是肉制品的主要成分之一，在肉類加工中脂質在脂肪酶和磷脂酶的作用下會產生游離脂肪酸，游離脂肪酸進一步氧化產生醛類、酮類、酯類等風味物質[21-22]。

因此，我們推測，添加了黑松露的中式香腸，其風味改善可能與香腸中脂類水解有關。而關于云南黑松露脂肪酶的相關研究鮮見報道。所以，本文對云南黑松露中的脂肪酶進行提取、純化，研究黑松露脂肪酶的酶學特性及其對中式香腸脂類的水解情況，探究黑松露改善中式香腸風味的原因，并為黑松露在食品中的應用和開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮肉、香辛料等：購于昆明市本地超市；干制黑松露（采自香格里拉）：由昆明市高上高食品有限公司提供；聚乙二醇2000（PEG2000）：天津百倫斯生物技術有限公司；油酸、三油酸甘油酯：上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：北京索萊寶科技有限公司；異丙醇（99.7%）：天津市風船化學試劑科技有限公司；正己烷、異丙醇、甲醇（色譜純）：CNW公司；D35-氘代硬脂酸（內標物98%）：Sigma有限公司；所有分離用的有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25-Basc高速勻漿機 德國IKA公司；HC-3018高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司；U-2910紫外分光光度計 日本日立公司；HI9024 pH計 意大利HANNA儀器公司；ZGDCY-24氮吹儀 上海梓桂儀器有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 中式香腸的制作

將原料肉切丁（大小約1 cm3），加入輔料拌勻，腌制2 h，裝入人造腸衣，扎孔排氣后放入52 ℃烘箱中烘烤24 h，冷卻，真空包裝，備用。中式香腸配方：原料肉500 g（肥瘦比3∶7），白砂糖40 g，食鹽10 g，味精10 g，飲用水40 g，高度白酒15 g，D-異抗壞血酸鈉60 g，亞硝酸鈉9 g。

1.3.2 黑松露脂肪酶的提取和純化

1.3.2.1 黑松露脂肪酶的提取

取適量黑松露，用預冷的4 ℃蒸餾水清洗，再用濾紙吸干，稱重5.00 g，剪碎，加入50 mL 4 ℃蒸餾水，用高速組織搗碎機搗碎2 min，再用離心機以4 000 r/min 的速度離心20 min，離心后取上清液即為粗酶液[23-24]。

1.3.2.2 黑松露脂肪酶的純化

雙水相萃取法：參照母應春等[25]的方法，并做適當修改。采用PEG2000/硫酸銨雙水相萃取體系，將4 mL PEG2000溶液、4 mL硫酸銨溶液、2 mL粗酶液在常溫下混合后靜置15 min分相[11]，取雙水相體系的上相即為脂肪酶純化酶液。

殼聚糖沉淀法：取4 mL粗酶液，加入2 mL殼聚糖醋酸溶液，混合后調pH至6.5，攪拌均勻后以5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，得到殼聚糖-脂肪酶復合物，復合物溶于4 mL且pH為3.8的醋酸鹽緩沖液中，劇烈攪拌30 min，使殼聚糖-脂肪酶復合物解離，以5 000 r/min離心20 min，進一步去除體系中少量的仍與脂肪酶結合的殼聚糖和體系中的鹽類及雜質，上清液即為脂肪酶純化酶液[26]。

雙水相-殼聚糖結合法：簡稱結合法，將上述雙水相萃取法提取的脂肪酶溶液再用殼聚糖沉淀法進行進一步的純化，得到最終脂肪酶純化酶液。

1.3.3 脂肪酶驗證試驗

將豬背膘切丁（0.3 cm3），稱取10 g分別置于2支試管中，一支加入2 mL結合法純化的脂肪酶酶液，另一支加入2 mL蒸餾水作為對照組，于50 ℃反應24 h后測定酸價。稱取20 g樣品，參照GB 5009.229－2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》中第一法指示劑滴定法進行測定，每個樣品測定3次。

1.3.4 黑松露脂肪酶純度和酶活力的測定

采用雙水相萃取法、殼聚糖沉淀法、結合法對粗酶液進行純化，對3個方法純化后的脂肪酶比活力、蛋白質含量進行測定，確定黑松露脂肪酶的最佳純化方法。

蛋白質含量的測定：參照徐亞等[27]的方法，采用考馬斯亮藍法測定脂肪酶酶液中的蛋白質含量。

黑松露脂肪酶酶活力的測定：參照王琪等[28]的方法，采用銅皂法測定脂肪酶比活力。

1.3.5 黑松露脂肪酶酶學特性的研究

將最佳方法純化的酶液用于酶學性質研究。

1.3.5.1 溫度對黑松露脂肪酶酶比活力的影響

每支試管中加入2 mL黑松露純化的脂肪酶酶液，分別置于25，30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃的水浴中反應30 min后測定酶比活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活。

1.3.5.2 溫度對黑松露脂肪酶穩定性的影響

分別取15 mL黑松露純化的脂肪酶酶液置于40，50，60，70，80，90 ℃條件下孵育60 min，以最高酶活力為100%計算相對酶活。

1.3.5.3 pH對黑松露脂肪酶酶活力的影響

取黑松露脂肪酶酶液1 mL與pH分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液以1∶1的體積比置于試管中，在50 ℃下反應15 min后測定酶比活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活。

1.3.5.4 pH對黑松露脂肪酶穩定性的影響

取黑松露脂肪酶酶液1 mL與pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液以1∶1的體積比置于試管中，在4 ℃的環境下反應12 h，測定酶比活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活。

1.3.6 酶動力學試驗

在最適反應條件（溫度50 ℃、pH 5）下，設置不同底物濃度，測定脂肪酶酶比活力。以底物濃度（1/[S]）為橫坐標、反應速率倒數（1/V）為縱坐標進行Lineweaver-Burk雙倒數作圖，根據擬合得到的直線與坐標軸交點位置，計算米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）[29]。

1V=KmVmax×1[S]+1Vmax。

式中：V為酶促反應速率；Vmax為最大反應速率；Km為米氏常數；[S]為底物濃度。

1.3.7 黑松露對中式香腸脂肪酸的影響

試驗采用氣相色譜-質譜聯用法對不滅酶（黑松露不經過熱處理添加到中式香腸中，簡稱HT組）和完全滅酶（黑松露經過90 ℃熱處理60 min添加到中式香腸中，簡稱CK組）的香腸游離脂肪酸的組成及含量進行定性定量分析，游離脂肪酸的具體測定方法如下。

樣品的預處理：取1 g剪碎混合均勻的香腸樣品于20 mL離心管中，加入9.6 mL的提取液（異丙醇∶正己烷為2∶3），再加入40 μL的D35-氘代硬脂酸內標物（1 mg/L，溶于正己烷），渦旋振蕩10 s，加入鋼珠；用40 Hz研磨儀處理4 min后超聲處理5 min（超聲過程中需要保持冰水浴）；將處理后的樣本置于4 ℃、12 000 r/min下離心15 min；離心后移取4 mL上清液于10 mL離心管中，氮氣吹干。加入2 mL甲醇、1 mL三甲基硅烷基重氮甲烷，渦旋振蕩10 s混勻，室溫下靜置15 min，再次用氮氣吹干；加入1.6 mL正己烷復溶，以12 000 r/min離心5 min，取上清液于樣品瓶中，進行GC-MS檢測[30]。

GC-MS分析條件：進樣量1 μL，分流比5∶1，隔墊吹掃流速3 mL/min，載氣He，色譜柱DB-FastFAME（90 m×250 μm×0.25 μm），柱壓46 psi，柱箱升溫程序為50 ℃保持1 min，以50 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持15 min，以2 ℃/min的速率升溫至210 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持16.5 min。前進樣口溫度240 ℃，傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離電壓－70 eV，質量掃描范圍（m/z）：33～400，掃描模式SIM，溶劑延遲7 min[31]。

C=Cs×V1×V2M×V3。

式中：C為樣本中游離脂肪酸的含量，μg/g；Cs為復溶液游離脂肪酸的濃度，mg/L；V1為復溶體積，mL；V2為加入提取液的體積；V3為取出提取液的體積；M為樣品質量，mg。

1.4 數據處理

采用SPSS 25.0和OriginPro 2018C軟件進行數據分析與圖形繪制，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 黑松露脂肪酶的純化

由圖1中A和B可知，黑松露脂肪酶粗酶液的總蛋白含量為1.78 mg/mL，酶比活力為6.17 U/mg。分別采用雙水相萃取法、殼聚糖沉淀法、結合法3種方法對脂肪酶粗酶液進行純化，3種方法純化后的酶液總蛋白質含量顯著下降（P＜0.05），酶比活力顯著提高（P＜0.05），說明黑松露脂肪酶粗酶液得到了進一步的提純。其中，采用結合法純化的效果最佳，酶比活力顯著高于雙水相萃取法和殼聚糖沉淀法（P＜0.05），酶比活力達到42.98 U/mg，與粗酶液相比，純化倍數達到7.1倍。因此，本文采用結合法純化的黑松露脂肪酶完成后續的相關研究。

用結合法純化后的酶液對肥膘肉進行脂質降解測試，結果見圖2。添加純化酶液的試驗組酸價顯著高于對照組（P＜0.05），說明純化后的脂肪酶酶液可以分解肥膘肉產生游離脂肪酸，從而提高酸價。

2.2 黑松露脂肪酶酶學性質

2.2.1 溫度對黑松露脂肪酶酶活力的影響

脂肪酶的酶比活力作為一項重要指標來表征脂肪酶的催化能力[32]。由圖3可知，隨著處理溫度的升高，黑松露脂肪酶的相對酶活逐漸上升，在50 ℃時達到最高，繼續升溫，相對酶活急劇下降。當溫度在25～55 ℃時，相對酶活保持在50%以上，說明25～50 ℃對黑松露脂肪酶有一定的催化作用，超過50 ℃對相對酶活有一定的抑制作用。原因可能是在一定溫度范圍內，溫度可以催化酶的活性中心，從而提高酶活力[33]。當溫度超過一定范圍時，高溫會改變蛋白內部的二級結構，從而改變蛋白質空間構象，破壞蛋白質結構的穩定性，最終使酶喪失活性[34-35]。因此，黑松露脂肪酶的最適溫度為50 ℃。

2.2.2 溫度對黑松露脂肪酶穩定性的影響

黑松露脂肪酶在40～90 ℃孵育60 min后酶的穩定性見圖4。

由圖4可知，40 ℃時黑松露脂肪酶相對酶活為95.35%，50 ℃時相對酶活達到最高，繼續升溫，相對酶活顯著下降（P＜0.05），在60 ℃時，相對酶活只有56.30%。在80 ℃時，相對酶活力基本趨近于0，說明黑松露脂肪酶在40～50 ℃時酶活力相對穩定。

2.2.3 pH對黑松露脂肪酶酶活力的影響

在50 ℃、pH 3.0～8.0的條件下測定脂肪酶的相對酶活，結果見圖5。

由圖5可知，隨著pH的增加，黑松露脂肪酶的相對酶活顯著升高（P＜0.05），pH為5時達到最高，pH＞5之后，酶活力顯著下降（P＜0.05），pH＞7之后趨于平緩，相對酶活只有33%～34%。原因可能是酶分子有許多極性基團，這些基團在不同的pH下解離狀態不同，在最適pH下才能與底物很好地結合，起到最大的催化作用[36]。因此，黑松露脂肪酶的最適pH為5.0。

2.2.4 pH對黑松露脂肪酶穩定性的影響

黑松露脂肪酶在4 ℃的環境下孵育12 h后不同pH下相對酶活見圖6。

由圖6可知，隨著pH的增加，相對酶活顯著升高（P＜0.05），pH為5時相對酶活最高。隨著pH值的繼續增加，相對酶活顯著下降（P＜0.05），pH為7.5時，相對酶活不再顯著下降（P＞0.05），但相對酶活只有42.10%。原因可能是不同的pH會影響酶與底物的結合。當pH改變不是很劇烈時，黑松露脂肪酶雖未變性，但是酶活力也有所降低。而pH過酸或過堿，會影響酶的活性部位使酶的空間結構改變，從而使酶失活[37]。pH為4～6時，相對酶活＞77%。因此，pH在4～6范圍內較穩定。

2.3 酶動力學結果

純化后的酶液在最適反應溫度為50 ℃和pH為5的條件下，以不同濃度的橄欖油為底物，測定脂肪酶酶比活力，計算相應的反應速度。采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，以底物濃度（1/[S]）為橫坐標、反應速率倒數（1/V）為縱坐標，根據擬合得到的黑松露脂肪酶的線性方程為Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。

2.4 黑松露對中式香腸脂肪酸的影響

中式香腸游離脂肪酸的種類及含量見表1和表2。

由表1和表2可知，CK組香腸共檢出25種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸10種，單不飽和脂肪酸6種，多不飽和脂肪酸9種。HT組香腸共檢出28種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸12種，單不飽和脂肪酸6種，多不飽和脂肪酸10種。HT組香腸的游離脂肪酸總含量顯著高于CK組，約是CK組的1.8倍。HT組的3種脂肪酸總量均顯著高于CK組（P＜0.05），且含量均約為CK組的2倍，CK組和HT組三大類脂肪酸的比例變化不大，分別為1∶2.06∶1.28和1∶2.03∶1.16。兩組中單不飽和脂肪酸含量均最高，其次是多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸。

飽和脂肪酸中月桂酸和二十一烷酸只在HT組中檢出，HT組的肉豆蔻酸、二十烷酸含量均顯著高于CK組（P＜0.05），棕櫚酸、硬脂酸含量均極顯著高于CK組（P＜0.01）。單不飽和脂肪中HT組的棕櫚油酸、油酸、十九碳烯酸含量極顯著高于CK組（P＜0.01），二十碳烯酸含量顯著高于CK組（P＜0.05），且油酸含量是CK組的1.75倍。多不飽和脂肪酸中HT組的亞油酸含量極顯著高于CK組（P＜0.01），約為CK組的1.75倍。亞麻酸、二十碳二烯酸含量顯著高于CK組（P＜0.05）。花生四烯酸只在HT組檢出。

由此可知，添加未滅酶的黑松露到中式香腸中，可以提高游離脂肪酸的含量，尤其是優質脂肪酸，因此，黑松露的添加可以促進中式香腸風味前體物質的產生。

3 結論

采用雙水相-殼聚糖結合法純化黑松露脂肪酶的效果最好，酶比活力達到最高42.98 U/mg。黑松露脂肪酶的最適溫度為50 ℃，在40～50 ℃范圍內酶活力較穩定，最適pH值為5.0，pH在4～6范圍內酶活力較穩定。采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法擬合得到Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。將黑松露經過滅酶和不滅酶處理后添加到中式香腸中，HT組中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的總含量顯著高于CK組（P＜0.05），且三大類脂肪酸的比例變化不大。單不飽和脂肪酸在兩組中占比均最高，接近50%。與CK組相比，HT組新增月桂酸、二十一烷酸和花生四烯酸，4種飽和脂肪酸、4種單不飽和脂肪酸和3種多不飽和脂肪酸的含量顯著提高（P＜0.05）。因此，在中式香腸中添加黑松露，可以促進脂質的水解，從而增加中式香腸的優質脂肪酸含量和促進風味前體物質的生成。

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