糖代謝異常患者外周血Treg和Th17細胞的變化

沈 艷，李文花，龍密密，譚玉潔

（1.六盤水市人民醫院檢驗科，貴州 六盤水 553000；2.貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004）

糖代謝異常（GM）是機體葡萄糖代謝出現異常的一類疾病，包括糖尿病（DM）前期和DM。DM 的發生與遺傳、環境及自身免疫等多種因素有關，但其具體病因目前尚未明確。近年來的研究表明，DM 是以高血糖為主要特征的低度炎癥性疾病[1]，而炎癥的發生與機體免疫狀態密切相關，已有文獻報道DM 的發生與免疫功能紊亂有關[2-3]。Th17 細胞是一種不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 細胞，在各種傳染性疾病、癌癥和許多自身免疫性疾病的發生發展中起著重要作用。Treg 細胞是一種具有免疫調節功能的免疫抑制性T 細胞，與多種免疫性疾病的發病機制或免疫狀態密切相關，在維持機體免疫穩態和調控免疫應答方面發揮著重要作用。Treg 細胞分泌的轉化生長因子-β（TGF-β）細胞因子可促進Th17 細胞的分化，提示Th17 細胞與Treg 細胞的分化存在密切的聯系。Th17細胞與Treg 細胞之間處于動態平衡狀態，若這種平衡狀態被打破則易發生炎癥及自身免疫性疾病。目前，DM 中關于Treg 細胞的研究尚存在爭議。本研究擬通過觀察GM 患者外周血Th17 細胞和Treg 細胞數量的變化，探討GM 時機體免疫功能及其平衡調節的變化情況，明晰相關免疫細胞在GM 發生發展中的作用，以期為GM 的發生機制及治療策略研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取貴州醫科大學附屬醫院門診及住院部的GM患者78 例為研究對象，其中男45 例，女33 例，年齡11 ～75 歲，平均年齡（47.53±15.68）歲。在這些患者中，有T1DM 患者18 例，DM 前期患者20 例，T2DM 初診患者20 例，T2DM 伴并發癥患者20 例。GM 分類符合1999 年世界衛生組織（WHO）糖尿病專家委員會提出的相關標準。對照組為我院同期健康體檢者20 例，其中男8 例，女12 例，年齡28 ～79 歲，平均年齡（46.15±13.44）歲。健康體檢者與GM 患者的性別及年齡相比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

CD4-FITC、CD25-PE-Cy?7、IL-17A-PE、A-Fluor 647-CD127（均為鼠抗人），同型對照FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、Alexa Fluor?647 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO、PE Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、PE-Cy ?7 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO，刺激劑+ 蛋白轉運抑制劑，均為美國BD 公司生產。FACS Canto Ⅱ流式細胞儀由BD 公司制造。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有研究對象均隔夜禁食8 ～12 h，采集清晨空腹靜脈血2 mL，置于EDTA-K2 真空抗凝采血管內，混勻后于室溫下保存，用于檢測Treg 細胞和Th17 細胞的表達。

1.3.2 Treg 細 胞 檢 測 取CD4-FITC、A-Fluor 647-CD127 各5 μL、CD25-PE-Cy?7 1.25 μL，加 入50 μL EDTA-K2 抗凝血，震蕩混勻后于室溫下避光孵育30 min。加入溶血素1 mL，震蕩混勻后于室溫下溶血5 min，然后再置于37 ℃恒溫水浴箱中溶

血5 min。待血融透后，加入3 mL PBS，震蕩混勻后用低速離心機以1500 r/min 的轉速離心5 min，洗滌兩次，加入0.3 mL PBS 重懸細胞，混勻后上機檢測。收集20 000 個淋巴細胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+CD25+CD127low 細胞占CD4+T 細胞的百分比（Treg/CD4+T%）。

1.3.3 Th17 細胞檢測 用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMC），加入PBS 至1 mL，重懸細胞，混勻備用。取24 孔細胞培養板，每孔加入1 mL含10%FBS 的1640 培養基，然后加入上述制備好的細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，用移液槍吹打混勻，再加入2 μL 刺激劑+蛋白轉運抑制劑，吹打混勻，置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養刺激6 ～8 h。加入PBS，以1500 r/min 的轉速離心5 min，洗滌兩次，加入10 μL 的CD4-FITC，4 ℃下避光孵育30 min。加入PBS，以1500 r/min 的轉速離心5 min，洗滌2次，加入固定/ 破膜洗液1 mL，顛倒混勻，4 ℃下避光孵育1 h。加入固定/ 破膜洗液1 mL，以1500 r/min的轉速離心5 min，洗滌2 次；加入10 μL IL-17APE，4 ℃下避光孵育50 min。加入固定/破膜洗液1 mL，以1500 r/min 的轉速離心5 min，洗滌2 次，加入300 μL的PBS 重懸細胞，上機檢測。每管收集20 000 個淋巴細胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+IL-17A+細胞占CD4+T 細胞的百分比（Th17/CD4+T%）。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 GM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的對比

與NC 組比較，GM 組的Treg/Th17 降低，Treg和Th17 細胞均升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 GM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的對比（± s）

表1 GM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的對比（± s）

注：**與NC 組比較，P ＜0.01。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17 GM 組（n=78）4.67±1.04** 1.49±0.38** 3.28±0.96**NC 組（n=20）3.62±0.64 0.83±0.19 4.54±1.19

2.2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的對比

與NC 組比較，不同病程（DM 前期、T2DM 初診、T2DM 伴并發癥）GM 組的Treg 和Th17 細胞均升高（除DM 前期組的Treg 細胞），Treg/Th17 均降低（P＜0.05），且隨著病程進展，Treg 和Th17 細胞逐漸增加，Treg/Th17 逐漸降低，其中以T2DM 伴并發癥組最為明顯。詳見表2。

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的對比（± s）

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的對比（± s）

注：**組間比較，P ＜0.01；a 與NC 組比較，P ＜0.05；b 與DM 前期組比較，P ＜0.05 ；c 與T2DM 初診組比較，P ＜0.05。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17 DM 前期（n=20）4.10±0.79 1.14±0.17a 3.69±0.92a T2DM 初診（n=20）4.38±0.75a 1.41±0.22ab 3.22±0.94a T2DM 伴并發癥（n=20）5.21±1.30abc 1.78±0.23abc 2.96±0.78ab NC 組F 值P 值4.54±1.19 10.047 0.000**3.62±0.64 10.777 0.002**0.83±0.19 78.104 0.000**

2.3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的對比

與NC 組比較，T1DM 組和T2DM 組的Treg 和Th17細胞均升高，Treg/Th17 均降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的對比（± s）

表3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的對比（± s）

注：**組間比較，P ＜0.01 ；a 與NC 組比較，P ＜0.05。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17 T1DM 組（n=18）5.04±0.85a 1.65±0.46a 3.27±1.08a T2DM 組（n=40）4.80±1.13a 1.60±0.29a 3.09±0.86a NC 組（n=20）F 值P 值3.62±0.64 12.963 0.000**0.83±0.19 45.492 0.000**4.54±1.19 14.380 0.000**

3 討論

Treg 細胞能分泌多種具有免疫調節功能的細胞因子，抑制效應T 細胞的免疫應答，與多種免疫性疾病的發病機制或免疫狀態密切相關，在維持機體免疫穩態和調控免疫應答方面具有重要作用。Th17 細胞是一種不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 細胞，主要分泌白細胞介素-17（IL-17），受轉錄因子RORrt 的分化調控，在各種傳染性疾病、癌癥和許多自身免疫性疾病的發生發展中起著重要作用。本研究中對所有研究對象均進行外周血Treg 細胞和Th17 細胞檢測，結果發現GM 組的Treg 細胞和Th17 細胞均升高，Treg/Th17 比值降低。國內外相關研究指出，Th17 細胞在DM 中表達上升，增加的Th17 細胞可分泌效應因子，調節許多致炎因子的表達，從而引起DM 患者的胰島β 細胞損害和死亡[4]。Treg 細胞在DM 的發生發展中發揮著重要作用，DM 患者體內的Treg 細胞存在數量或功能的缺陷。據報道，Treg 細胞對機體的免疫保護機制減弱可增強慢性炎癥的刺激及增加炎性因子的分泌，導致胰島素敏感性進一步減弱，引起DM 的發生發展。研究發現，Treg 細胞在DM 的發病初期就會增加。也有研究發現，T1DM 患者體內的Treg 細胞表達高于對照組。現階段，關于Treg 細胞的研究尚存在爭議，可能與地區差異或研究人群異質性有關。本文數據顯示，GM 患者的Treg 細胞和Th17 細胞均隨病程進展而逐漸增加，Treg/Th17 比值逐漸降低，其中以T2DM 伴并發癥者最為明顯。Th17 細胞在DM 前期就開始增加，而Treg 細胞在T2DM 初診時才開始增加。Hotamisligil 于1993 年首次在肥胖小鼠的脂肪組織中發現炎癥因子與DM 的發生有關。隨后的研究發現，在DM 發病前數年，患者體內就有炎癥反應增強的跡象，而當DM 伴并發癥時，這種炎癥反應有所增強[5]。本研究中通過觀察不同類型的DM 患者，我們還發現T1DM 組和T2DM 組的Treg 細胞和Th17 細胞均明顯增加，提示Treg 細胞和Th17 細胞參與了T1DM 和T2DM 的發病機制。Th17 細胞通過分泌細胞因子導致炎癥反應放大，引起胰島β 細胞損害和死亡，最終導致DM 的發生[6]；Treg 細胞與效應T 細胞競爭白細胞介素-2（IL-2），造成效應T 細胞凋亡，導致機體免疫功能紊亂，誘發T1DM 等免疫性疾病[7]。Treg 細胞還可增強慢性炎癥的刺激及增加炎性因子的分泌，導致胰島素敏感性進一步減弱，誘發T2DM。有學者研究發現，T1DM 患者體內的Treg 細胞表達高于對照組。而Glisic 等[8]發現，T1DM 患兒的Treg 細胞中一些相關細胞因子低于正常對照組。可見，在病理情況下盡管機體代償增加了Treg 細胞的數量，但此類細胞可能存在功能缺陷，并不能通過調節或分泌作用產生相應水平的細胞因子。

綜上所述，GM 的發生與機體細胞免疫缺陷及體液免疫過度激活有關，主要表現為外周血Treg/Th17平衡的異常。GM 患者的Treg 細胞和Th17 細胞均隨病程進展而逐漸增加，Treg/Th17 逐漸降低，其中以T2DM 伴并發癥者最為明顯。Th17 細胞在DM 前期就開始增加，而Treg 細胞在T2DM 初診時才開始增加。T1DM 和T2DM 患者的Treg 細胞和Th17 細胞均明顯增加，提示Treg 細胞和Th17 細胞參與了T1DM 和T2DM 的發病機制。因此，在臨床工作中我們應重視T2DM 的發生與免疫機制的關系。