基于網絡藥理學和分子對接探討解毒通利方治療肝纖維化的作用機制

陳宇彬，林潔，蔡媛媛，程亞偉，李冠慧，蔡敏

1.廣州中醫藥大學附屬海南中醫院，海南 海口 570203；2.海南省中醫院，海南 海口 570203

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指肝臟細胞外基質的彌漫性過度沉積，是各種慢性肝病向肝硬化發展的關鍵階段，對慢性肝病的預后起著決定性作用[1-2]。慢性肝病包括肝炎病毒、代謝和遺傳、膽汁淤積、免疫異常、乙醇、藥物與毒物、寄生蟲等病因所致的病程超過半年的各種肝病[3]。HF病情持續進展可引起肝硬化、肝衰竭、肝性腦病等嚴重并發癥，威脅患者健康和生命。

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是HF形成的關鍵環節[4]，HSC 的激活是由大量的炎性細胞因子和生長因子介導的，其中，轉運生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是肝損傷、炎癥、肝再生、肝纖維化和肝細胞癌的中樞調節因子[5]。在HF過程中，TGF-β能夠促進肝祖細胞的形態學改變和遷移，而進一步進行信號通路分析發現，此過程涉及多種信號通路[6]。HSC激活并增殖，產生大量的細胞外基質，因此抑制HSC的激活和增殖是預防和治療HF的重要方法，對相關靶蛋白和信號通路進行深入研究是HF新藥研發工作的重點。

目前，臨床上尚無特異有效的抗HF的治療方案，HF目前最重要的是病因治療，但療效仍存在一定的局限性。由于HF 病理機制復雜，針對單一靶標的藥物研發很難在臨床上奏效，中藥復方具有多成分、多靶點、不良反應少等優點，中醫藥近年來已成為防治HF的研究熱點，廣泛開展的實驗研究與應用實踐證實了其在HF防治領域中醫的特色優勢與突出療效[7]。

海南省名中醫蔡敏教授基于“初病濕熱在經”提出以清熱利濕為法，治療HF初期濕熱階段，將治療關口前移，以提前干預HF 的持續發展過程和不良結局[8]。因此，蔡敏教授根據數十載臨證及用藥經驗創制了治療本病的經驗方：解毒通利方。本方源自《傷寒論》清熱利濕退黃經典方劑茵陳蒿湯，諸藥加減兼顧清熱解毒、調氣行血、健脾扶正。此外，方中運用了多種海南特色南藥、黎藥，使本方具有一定的地域特色與民族特色，如地耳草，又名田基黃，黎醫用于治療黃疸，體現了黎醫“以黃治黃”的用藥特點[9]。解毒通利方臨證中屢獲良效，本研究通過網絡藥理學的方法探討解毒通利方治療HF 可能的作用機制，并通過分子對接技術在計算機層面模擬驗證，旨在為將來進一步開展解毒通利方治療HF的藥效學機制體內外實驗研究提供初步科學假說與依據。

1 資料與方法

1.1 獲取解毒通利方的活性化合物及有效活性成分靶點 以茵陳、大黃、梔子、雞骨草、地耳草、鳳尾草、白花蛇舌草、丹參、葉下珠、雞內金、神曲、甘草分別作為關鍵詞,在TCMSP 數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、HERB 數據庫(http://herb.ac.cn/)中進行化合物成分檢索，設置口服生物利用度(OB)過濾條件≥30%，類藥性(DL)過濾條件≥0.18。通過TCMSP 數據庫將上述活性化合物進行成分靶點檢索。運用UniProt 數據庫(http://www.uniprot.org)下載人類靶蛋白，最后，使用處理文本文件的Perl語言對篩選出的活性成分的靶點信息與之匹配和規范。

1.2 檢索HF 的疾病靶點 在人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、藥物遺傳學和藥物基因組織學數據庫(PharmGkb，https://www.pharmgkb.org/)、藥物靶點數據庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、人類在線孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https://omim.org/)、Drugbank 數據庫(https://www.drugbank.ca)中檢索關鍵詞“Hepatic fibrosis”、“Liver fibrosis”以獲得HF的疾病相關靶點。

1.3 確定解毒通利方治療HF的作用靶點 將篩選出的解毒通利方有效活性成分靶點數據與HF疾病靶點數據使用R 語言4.1.2 程序取交集，并繪制韋恩圖。從而確定解毒通利方治療HF的作用靶點。

1.4 蛋白互作(PPI)網絡構建與關鍵靶點 將解毒通利方有效活性成分與HF 疾病交集靶點數據，即1.3中得到的結果上傳至STRING數據庫(https://www.string-db.org/)進行PPI 網絡構建，物種參數選定為“Homosapines”，自定義可信度＞0.95 和隱藏游離點，構建PPI 網絡。將PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.8.0中，應用“CytoNCA”插件篩選核心靶點，通過打分對節點賦值，選中分值高的節點構建新的網絡，重復進行以上“打分—選中—構建”這一過程以獲得核心靶點。

1.5 “中藥—關鍵化合物—核心靶點”網絡構建 將1.4中獲得的核心靶點名稱和其對應的關鍵化學成分整理成表格文件，導入Cytoscape 3.8.0軟件中，并構建“中藥—關鍵化合物—核心靶點”網絡。應用“Networkanalyzer”插件獲得節點的度值。通常看來，節點度值高，將被視作有意義的活性化合物或作用靶點，能夠在自身所處的生物網絡中發揮樞紐性的作用[10]。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 基于R 語言4.1.2 程序Bioconductor、Pathview 等數據包，設定P＜0.05 為差異有統計學意義，對交集靶點數據進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，選取GO 富集分析前10 名BP、CC、MF 結果和KEGG 通路富集分析前10 名結果進行可視化。

1.7 分子對接模擬驗證 首先，從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載所選擇的活性化合物即小分子配體的2D 結構，并使用Chem Office 軟件轉化為3D 結構，運行energyminimize 后保存。第二，通過PDB 數據庫(http://www.rcsb.org)下載大分子蛋白受體的3D結構，使用Pymol軟件對蛋白受體和化合物配體進行去除水分子等操作。第三，利用Auto Dock Tools 軟件對受體進行加氫，確定配體與受體結合的活性口袋[11]。最后，運用Auto Dock vina 軟件將兩者進行對接，計算配體和受體結合的最低結合效能，據此進行排序，并在Pymol軟件中對分子對接結果進行展示。

2 結果

2.1 解毒通利方活性化合物與有效活性成分靶點 通過TCMSP數據庫和HERB數據庫，篩選出活性化合物172種，其中茵陳10種、大黃4種、山梔子6種、雞骨草1種、地耳草2種、葉下珠1種、白花蛇舌草1種、雞內金1 種、神曲1 種、丹參54 種、甘草81 種。運用TCMSP 數據庫預測獲得的活性化合物靶點信息，經Uniprot數據庫、Perl語言對應與規范靶點基因名匯總刪重后，共預測靶點4 068 個，其中茵陳306 個、大黃27個、山梔子276個、雞骨草59個、地耳草248個、葉下珠271個、白花蛇舌草190個、雞內金4個、神曲204個、丹參799個、甘草1 494個。

2.2 HF的疾病靶點 在Gencards數據庫里檢索獲得到HF 疾病相關基因4 855 條，PharmGkb 數據庫獲得31個基因，OMIM數據庫獲得63個基因，TTD數據庫獲得21個基因，Drugbank數據庫獲得13個基因，將以上5 個數據庫檢索獲得的基因數據整合去重，共獲得HF疾病相關基因4 877個，見圖1。

圖1 HF疾病靶點提取Figure 1 Extraction of HF disease targets

2.3 解毒通利方治療HF的核心靶點 將篩選出的解毒通利方的有效活性成分靶點數據與HF疾病靶點數據使用R 語言4.1.2 程序(bioconductor 等數據包)取交集，獲得解毒通利方治療HF 的核心靶點199 個，并繪制韋恩圖，見圖2。

圖2 HF與解毒通利方交集靶點的韋恩圖Figure 2 Wayne diagram of the intersecting target of HF and Jiedu Tongli Decoction

2.4 PPI 網絡構建與關鍵靶點 如圖3 所示，PPI網絡中共有156個節點，1 088條邊。應用“CytoNCA”插件篩選核心蛋白，通過打分對節點賦值，選中分值高的節點構建新的網絡，重復進行以上“打分—選中—構建”這一過程，篩選出19 個核心蛋白，分別為CDKN1A、IL6、MAPK14、AKT1、HSP90AA1、TNF、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、RB1、MYC、FOS、STAT3、MDM2、MAPK1、HIF1A、TP53、CCND1，見圖4。

圖3 PPI網絡構建Figure 3 PPI network construction

圖4 解毒通利方與HF交集靶點的PPI網絡Figure 4 PPI network of intersecting targets of Jiedu Tongli Decoction and HF

2.5 “中藥—關鍵化合物—核心靶點”網絡構建“中藥—關鍵化合物—核心靶點”網絡共由156個節點和304 條邊組成(圖5)。網絡中的邊表示相互作用，“中藥—關鍵化合物—核心靶點”網絡圖展示了關鍵化合物與核心靶點兩者之間并非一一對應的關系。一個化合物可以同時作用于多個靶點發揮活性作用，反過來說，一個靶點可以同時受多個化合物調節產生不同影響[10]，這種相互的、復雜的、多元的作用模式反映了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用潛能與優勢。根據網絡的節點度值參數排序，排名前5 的化合物分別為甘草查爾酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)、異鼠李素(isorhamnetin，MOL000354)、去甲氧基茵陳色原酮(demethoxycapillarisin，MOL008046)、5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone(MOL003095)，從靶點來看，排名前5的分別是HSP90AA1、ESR1、MAPK14、RELA和MAPK1。

2.6 GO富集 GO富集分析共得到2 612條生物過程(BP)相關條目、234 條分子功能(MF)相關條目、89條細胞組分(CC)相關條目。基于R 4.1.2程序，根據參與的分子數量，對前10 位的BP、CC、MF 進行可視化，以條形圖展示(圖6)。生物過程主要涉及氧化應激、化學應激、氧水平感知等。分子功能主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性和細胞因子受體結合等。細胞組分主要涉及膜閥、轉錄調節復合物、蛋白激酶復合物等。

圖6 GO注釋分析的前10名BP、CC和MF結果Figure 6 Top 10 BP,CC,and MF results in GO analysis

2.7 KEGG通路富集 通過KEGG富集結果篩選出181條通路(P＜0.05)，提示解毒通利方可能通過調控多條通路起到治療HF 的作用。根據P值篩選KEGG結果前30名通路使用R 4.1.2程序進行可視化，繪制氣泡圖(圖7)。通路富集以病毒感染、炎癥反應、細胞凋亡、脂質代謝、腫瘤等相關的信號通路為主，具體涉及PI3K/AKT信號通路、白細胞介素17(IL17)信號通路、T輔助細胞17(Th17)細胞分化、乙型肝炎、丙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路、糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、流體切應力與動脈粥祥硬化、愛潑斯坦—巴爾病毒感染、癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、內分泌抵抗等通路。進一步利用R語言4.1.2程序基于Pathview數據包提取信息，繪制與HF疾病的通路圖。從通路圖中可以看出AKT、STAT3 等在HF 發病過程中起到重要作用，HF的靶點是多路徑協調控制的(圖8)。

圖7 前30名KEGG通路富集圖Figure 7 Top 30 pathways in KEGG pathway enrichment analysis

圖8 靶點在HF疾病中的通路圖Figure 8 Pathway map of targets in HF disease

2.8 分子對接驗證 基于以上結果，AKT1 和STAT3 為PPI 網絡核心中的關鍵蛋白，甘草查爾酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)均為網絡中排名前5 位的化合物，即關鍵有效活性成分。故選擇AKT1 和柚皮素、STAT3 和甘草查爾酮分別作為大分子蛋白受體和小分子化合物配體，進行分子對接。使用Autodockvina 進行分子對接，結果顯示AKT1 和柚皮素的結合自由能為-6.0 kJ/mol(圖9)，STAT3 和甘草查爾酮的結合自由能為-6.8 kJ/mol (圖10)，說明關鍵化合物與核心蛋白的結合構象能量低，結構穩定。

圖9 甘草查爾酮與AKT1分子對接Figure 9 Docking of licorice chalcone with AKT1 molecule

圖10 柚皮素與STAT3分子對接Figure 10 Docking of Naringenin with STAT3 molecules

3 討論

HF屬于中醫學“肝積”、“積聚”、“脅痛”、“黃疸”等范疇，中醫學認為本病是由感染疫毒或外感濕熱，邪毒羈留不去，以致氣血津液搏結，肝絡瘀阻，而發為本病。由于濕邪其性黏滯，與熱邪相合則出現濕熱膠著難解、肝病纏綿難愈之象，日久正氣為之所傷，逐漸由實而虛、由表及里，由氣入血形成“濕、熱、毒、瘀、虛”互結的復雜局面。治療上，不同醫家各有側重，但大多從瘀、虛論治。由于HF 往往存在病情持續進展的不良病程和結局，蔡敏教授從中醫治未病“既病防變”的理念出發，認為提前干預與及時治療更為重要。根據葉天士《臨證指南醫案》“初病濕熱在經，久則瘀熱入絡”的理論，蔡敏教授認為濕熱邪氣導致肝臟炎癥反應，是肝纖維化的始動因素[8]。在我國，特別是外感濕熱之邪而致的慢性乙型病毒性肝炎，肥人脾虛、痰濕內生、日久蘊熱為核心病機的非酒精性脂肪肝，均為常見慢性肝病的主要原因。濕熱日久，化瘀化熱，入里入絡，慢性肝炎活動的過程即HF 不斷發展的過程[12]。因此，蔡敏教授創造性地提出以清熱利濕為法治療本病，并總結出經驗方—解毒通利方。方中茵陳為君藥，清熱利濕，解毒退黃；大黃為臣藥，既入氣分，又入血分，可瀉下攻積，清熱解毒，利膽保肝，使濕熱從大便而出，此外，功兼活血行瘀；山桅子有清熱涼血之功，不僅可入胃蕩滌熱邪下行，還配伍茵陳走表利便，以助消解瘀熱，與大黃共為臣藥。蔡敏教授善用南藥、黎藥，在方中運用了雞骨草、田基黃、鳳尾草、葉下珠、白花蛇舌草等藥物，增強清熱利濕解毒之力，“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，故方中酌加神曲、雞內金以健運脾胃，先安未受邪之地，丹參化瘀涼血，甘草調和諸藥，全方清熱利濕、化瘀解毒、通利二便及血脈。

研究發現，解毒通利方中含有甘草查爾酮、柚皮素、異鼠李素、去甲氧基茵陳色原酮等活性成分對應的作用靶點較多，或在治療HF 中發揮重要作用。柚皮素可通過抑制氧化應激、炎癥等相關通路，如TGF-β/Smad3、JNK/Smad3 信號通路實現抗肝纖維化的效果[13]。動物研究還證實，柚皮素可通過抑制內質網應激與細胞凋亡減輕四氯化碳誘導的大鼠肝細胞損傷從而緩解HF[14]。異鼠李素可通過下調p38MAPK 信號通路、TGF-β/Smads 信號通路、TLR 信號通路減輕氧化應激、抑制細胞外基質生成等以減少膠原合成，進而改善HF[15-17]。

在PPI網絡中，IL-6、AKT1、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、MYC、FOS、STAT3、MAPK1、CCND1等19個靶點為解毒通利方治療肝纖維化的核心蛋白。AKTl是PI3K的下游信號蛋白，參與調節HSC的活化、增殖、分化和凋亡等過程[18]。此外，TGF-β能夠促進肝祖細胞的形態學改變和遷移，PI3K/AKT 信號為高富集信號通路[6]。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)可受Janus激活激酶2(JAK2)表達和活性增加而促進其生成，進而誘導IL-6及TGF-β1表達[19]，其中，IL-6能介導肝損傷的急性期反應[15]，還可以通過MAPK、JAK2/STAT3通路直接誘導HSC轉化為肌成纖維樣細胞，導致細胞外基質沉積[20]，促進肝纖維化。肝細胞中的MYC基因過度表達可促進HSC的活化[21]；肝實質細胞屬于靜止期細胞，在肝發育和再生過程中，RELA參與了關鍵的生物化學過程，RELA 缺乏會導致小鼠肝細胞變性和胚胎發育停止[22]。CCND1 可調控細胞增殖、DNA 修復及細胞遷移等[23]。

GO功能和KEGG通路富集分析結果表明，解毒通利方治療HF作用的靶點主要體現在氧化應激、細胞凋亡、炎癥、病毒感染、脂質代謝等生物學過程及調節PI3K/AKT 信號通路、TNF 信號通路、肝炎病毒感染、Th17 細胞分化、HIF-1 信號通路、腫瘤信號通路等方面。許多研究表明，下調TGF-β1[24]、lincRNA-p21[25]、炎癥介質等調節PI3K/AKT 信號通路，可以通過抑制HSC活化、肝實質細胞自噬[26]、減少肝實質細胞上皮細胞—間充質轉化[27]等途徑實現抗肝纖維化的作用。Varela-Rey 等[28]研究發現，大鼠肝星狀細胞內MAPK磷酸化可受TNF-α減少影響，從而調節I型膠原蛋白表達，使其產生的膠原更易降解。HF患者體內T淋巴細胞亞群發生改變，發揮抗炎效用的T 輔助細胞(T helper cells 17，Th17)和調節性T 細胞(regulatory T cells，Treg)，前者比例升高，后者較正常水平降低[29]，而Th17/Treg 平衡受JAK2/STAT3 調控[30]。除此之外，JAK2/STAT3信號通路可能通過HSC與纖維母細胞轉分化[31]、肝組織和膽總管纖維化相關蛋白表達[32]、巨噬細胞功能[33]等有關。HIF-1α是誘導細胞缺氧適應的關鍵轉化調節因子，相關報道稱MAPK也與HIF-1α活性調節有關，兩者均參與了缺氧條件下HSC的激活[34]。

在分子對接過程中，配體和受體分別選擇AKT1和柚皮素、STAT3和甘草查爾酮，結果顯示結合能為負值，構象能量低提示模擬對接雙方結構穩定、結合活性好，表明解毒通利方中關鍵化合物成分可能通過作用于靶蛋白AKT1、STAT3，調節PI3K/AKT、JAK2/STAT3信號通路，干預肝纖維化進程，促進機體修復，其作用機制可能與抑制HSC活化與上皮間質轉化有關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接技術初步預測與驗證了解毒通利方治療HF的關鍵活性成分、核心作用靶點及主要的信號通路，解毒通利方治療HF 的作用可能是通過柚皮素、異鼠李素等多種活性成分作用于IL-6、AKT1、STAT3、MAPK 等多靶點，通過PI3K/AKT、TGF-β/Smads、JAK2/STAT3 等多條信號通路來實現的，但仍需進一步體內外實驗研究驗證。本研究揭示了解毒通利方具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的分子機制，可為臨床治療HF及下一階段的深入研究提供參考。