酶解果膠制備寡聚半乳糖醛酸及其對漿果類果實成熟軟化的影響

胡倩，陳寧博，張樂樂，王延圣，楊瑩，路來風*

（1.天津市食品質量與健康重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.山東省農業科學院農產品加工與營養研究所，農業農村部新食品資源加工重點實驗室，山東省農產品精深加工技術重點實驗室，山東 濟南 250100）

果實軟化是成熟的重要標志，是一個復雜的細胞壁水解膨脹過程，包括果膠的水解及溶解、半纖維素和纖維素的解聚等[1-2]。果膠的降解是果實軟化過程中最顯著的變化，伴隨著細胞壁中膠層的溶解，大量細胞壁結構喪失以及細胞壁物質降解，導致細胞發生分離，果實軟化加劇[3-4]。成熟果品的適度軟化可以顯著提升其風味與口感，有助于增加果實的可食性，但不利于果實采后的運輸、貯藏與銷售。成熟軟化將削減果實在采后流通、貯藏與銷售過程中抵御機械損傷和病原微生物侵害的能力[5]。果實軟化會增加果實損傷風險，果實損傷后呼吸強度和乙烯釋放量增加，致使果實中的營養物質消耗加速、商品品質衰減；同時，為病原微生物提供侵染的直接入口，造成腐爛，果實軟化與果實損傷兩者閉環會加重生鮮果品損耗[6-7]。因此，如何控制果實采后軟化過程，成為減少果實機械損傷以及病理性腐爛的關鍵問題。

目前，控制果實軟化的主要措施包括：選擇合適的采前栽培方式和礦物質元素（鈣、磷、鉀等）補充劑、控制采收期與采后環境溫度、應用抗軟化保鮮劑[1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）]與可食涂膜等[8-9]。本課題組前期研究表明，特定組合條件下用果膠酶酶解產物，可較好地抑制番茄等果實的采后軟化和可溶性固形物產生過程；同時，促進番茄果實機械損傷愈合，愈合時間由原有自然狀態下的24 h 縮短至12 h 以內，且12 h 時的灰霉病發病率降低至0%[10-13]。寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonides，OGs）作為損傷相關模式分子（damage associated molecular patterns，DAMPs）激活植物免疫[14-15]，同時作為果實軟化過程中細胞壁的主要降解產物，對其生物學活性進行研究可以更好地解決果實生長發育及采后過度軟化等系列品質劣變問題。

為明確OGs 自身化學特性對減緩漿果果實軟化效果的影響及其減緩果實軟化的分子機制，本文擬以易腐爛、難貯藏的紅番茄果實為試驗對象，選取果膠酶酶解不同來源果膠制備OGs，評價不同來源OGs 對番茄果實硬度的影響；結合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及RNA 定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR） 技術研究OGs 與果實軟化關聯機制，并以紅提葡萄、藍莓、草莓等大宗漿果進行應用測試，以期為漿果果實成熟軟化及其所衍生的采后品質劣變防治挖掘新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣、青番茄、柑橘皮、甜菜渣、紅番茄、藍莓、紅提葡萄、草莓：市售，果實新鮮無傷，大小均勻一致。

果膠酶（30 000 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAiso Plus、PrimeScrieptTMRT Master Mix（Takara）、TB Green R Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）：寶日醫生物技術（北京）有限公司；無水乙醇、異丙醇、氯仿（均為色譜純）：天津康科德生物有限公司；無水乙醇（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、高甲酯果膠、低甲酯果膠（均為分析純）：索萊寶生物科技有限公司；鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UC-5830 超聲波清洗器：美國Ameritech 公司；DGG-101-2B 電熱鼓風干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；FDU-2110 冷凍干燥機：東京理化機械株式會社；Aglient1200 高效液相色譜儀、MX3000P 實時熒光定量PCR 儀：美國安捷倫公司；RID-20A 高效液相色譜系統示差折光檢測器：日本島津公司；GY-4 硬度計：浙江艾德堡儀器有限公司；AP-55 數顯折光儀：浙江艾銳普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熱水浸提法提取不同來源果實細胞壁果膠

參考王文駿[16]的方法預處理果實組織，將果實組織（蘋果渣、青番茄、紅番茄、橘皮、甜菜渣）放入90 ℃去離子水中，煮沸5 min，使果膠酶失活，并適當去除其中的苦澀物質、色素等雜質。用6 層紗布擠干水分后于50 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥，干燥后研磨粉碎，密封保存備用。

采用超聲輔助熱酸法提取果膠[17]，取一定質量果實粉末于去離子水中（用0.5 mol/L HCl 調節pH 值至1.53）。攪拌至充分溶脹，80 ℃提取2 h，每間隔20 min超聲處理5 min。體系溫度降至室溫后，12 000 r/min 離心30 min。果膠提取液與2 倍體積的95%乙醇溶液混勻，4 ℃冰箱冷藏2 h。9 000 r/min 離心30 min，保留下層沉淀，與95%乙醇溶液混合，充分混勻后9 000 r/min離心30 min，重復多次，直至形成幾乎透明的凝膠狀物質，于45 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒重，即得到果膠。

1.3.2 OGs 及不同甲酯果膠的酶解制備工藝流程

參考Yang 等[11]的方法并稍作修改，將1.3.1 提取的果膠、高甲酯果膠和低甲酯果膠用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.0）配制成0.5%的溶液，超聲（40 kHz）至果膠溶解無大塊顆粒，沸水煮沸后靜置冷卻。將果膠酶用緩沖液溶解并稀釋至1 000 U/mL，后將0.5%果膠溶液與酶液按3∶1（體積比）混合，磁力攪拌器50 ℃恒溫浸提12 h。反應結束后，將酶解產物煮沸5 min，使酶失活，隨后60 ℃旋轉蒸發將寡糖濃縮至15 mL后凍干，即得到粗OGs 組分、高甲酯寡聚半乳糖醛酸（highmethoxyl-oligogalacturonides，HM-OGs） 和低甲酯寡聚半乳糖醛酸（lowmethoxyl-oligogalacturonides，LM-OGs）。

1.3.3 OGs 的高效液相色譜檢測

參照冀麗鳳[17]的方法，將樣品用流動相配制成1 mg/mL 的溶液，各樣品通過0.22 μm 水系濾膜并超聲脫氣后進行寡糖組分檢測。色譜柱為UltrahydrogelTMColumn WAT011550（6 μm，7.8 mm×300 mm）串聯UltrahydrogelTMWAT011525（6 μm，7.8 mm×300 mm），接保護柱UltrahydrogelTMDP WAT011570（6 μm，6 mm×40 mm）。柱溫40 ℃；流動相為超純水，使用前用0.22 μm 水洗濾膜抽濾，超聲脫氣；流速0.6 mL/min。

1.3.4 OGs 處理紅番茄果實樣品制備及果實硬度測定

用打孔器（經75%乙醇溶液消毒）在紅番茄果實赤道板等距打3 個孔（直徑5 mm，深2 mm），每孔分別加入30.0 μL OGs 溶液（10 mg/mL），對照組加入等量的無菌水。靜置2 h 后，置于恒溫（28 ℃）恒濕（相對濕度90%～95%）環境中貯藏。于不同時間用無菌刀片在孔周圍取樣，并通過液氮快速冷凍，貯藏在-80 ℃冰箱中，用于基因相對表達量的測定。

使用硬度計（探針直徑3.5 mm）測定果實硬度，每顆果實測量赤道板3 個以上位置，每組測量8 個果實，試驗重復3 次。

1.3.5 qRT-PCR 檢測

番茄果實總RNA 提取及RNA 反轉錄參照Yang等[11]的方法進行。

選用CAC 作為內參基因，測定OGs 處理前后PL3、PG2、PL5 基因的相對表達量。實時熒光定量PCR 反應體系如下：10 μL TB Green Premix Ex Taqll（Tli RNaseH Plus）（2×），0.8 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye or Dye ll（50×），2 μL RT 反應液（cDNA溶液），6 μL 無酶水，反應總體系為20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，40 個循環，溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃30 s；95 ℃15 s。各基因引物如表1 所示。

表1 引物序列信息Table 1 Primer information

1.3.6 OGs 處理漿果果實及果實硬度、腐爛率、可溶性固形物含量測定

分別使用蘋果渣果膠制得的OGs 溶液（10 mg/mL）浸泡藍莓、紅提葡萄、草莓10 min，室溫晾干后，置于恒溫（28 ℃）恒濕（相對濕度90%～95%）環境中貯藏。參照1.3.4 的方法于第3 天和第7 天測定果實硬度。

參考趙煥蘭等[18]的方法，記錄貯藏第3 天及第7天果實腐爛個數，腐爛率計算公式如下。

式中：R 為腐爛率，%；S 為腐爛果實總數；T 為果實總數。

參考張彪等[19]的方法，使用數顯折光儀測定果實汁液中可溶性固形物含量。

1.4 數據處理與分析

用SPSS/PC ver.II.x（Statistical Product and Service Solutions）軟件進行統計分析。當組內比較個數為3 個及3 個以上時，數據采用ANOVA 進行鄧肯氏差異分析（取P<0.05）；組內個數為2 個時，采用獨立樣品t 檢驗進行平均數分離。每個單獨的試驗中每個處理至少設3 個以上重復，并按照完全隨機區組原則進行設計。采用Origin 7.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酶解不同來源果膠制得的OGs 對減緩紅番茄果實軟化的影響

以1 000 U/g 果膠酶酶解不同來源（蘋果渣、青番茄、紅番茄、橘皮、甜菜渣）果膠，考察制得的OGs 對紅番茄果實軟化的影響，結果如圖1 所示。

圖1 酶解不同來源果膠制得的OGs 對紅番茄果實軟化的影響Fig.1 Effect of OGs prepared by enzymatic hydrolysis of pectin from different sources on fruit softening of tomato

由圖1 可知，與添加無菌水的對照組相比，OGs 誘導組減緩紅番茄果實軟化效果明顯，不同來源果膠制得的OGs 抑制果實軟化效果存在明顯差異，橘皮來源OGs 軟化效果最好，紅番茄來源OGs 效果次之，分別是對照組硬度的1.68 倍和1.47 倍。考慮到蘋果渣、青番茄、紅番茄、橘皮及甜菜渣的單位質量果膠提取率為10.00%、1.00%、0.30%、2.00%和0.14%，從蘋果渣中所提取果膠的得率遠高于其他材料，后續選取蘋果渣來源果膠開展試驗。

對不同來源果膠制得的OGs 進行高效液相色譜測定，結果如圖2 所示。

圖2 酶解不同來源果膠獲得的OGs 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of OGs prepared by enzymatic hydrolysis of pectin from different sources

不同來源果膠經酶解所制得的不同聚合度的寡糖片段含量存在差異。本課題組前期利用柱分離結合質譜分析的研究結果表明，聚合度在2～5 之間的OGs具有較好的生物學效應[11，14]。由圖2 可知，通過高效液相色譜檢測，發現來源不同的果膠經酶解后OGs 中各組分分子量占比有所差異。不同來源（橘皮、蘋果渣、紅番茄、青番茄及甜菜渣）果膠制備的OGs 在14 min內組分的峰面積分別為5 941 899.3、4 967 682、4 687 725.5、3 834 910.5、835 302.2，進一步證明保留時間為14 min內的寡糖產物為OGs 的主要有效組分，該組分含量差異導致其減緩紅番茄軟化效果不同。

不同酯化程度果膠制備的OGs 處理紅番茄果實后硬度，以及不同酯化程度果膠及所制備OGs 的高效液相色譜如圖3 所示。

圖3 不同酯化程度果膠制備的OGs 對果實軟化的影響及高效液相色譜圖Fig.3 Effect of OGs prepared by pectin with different esterification degrees on fruit softening and HPLC

果膠是主要由半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）分子鏈組成的多聚糖，綴以少量的鼠李糖分子及半乳糖醛酸、木聚糖和一些其他五碳糖組成的小側鏈。其中，GalA 的羧基可以被甲酯化，而O-2 位、O-3位的羥基則可以被O-乙酰酯化，不同來源果膠的甲基化、乙?；潭炔煌琜16]。由圖3A 可知，用HM-OGs 和LM-OGs 處理紅番茄果實，兩者均能顯著減緩果實軟化，但HM-OGs 處理組硬度比LM-OGs 處理組高0.83 N。

由圖3B 可知，通過標準品建立標準曲線推算出保留時間在15.2 min 左右的產物為單糖。分別使用10 mg/mL的葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖誘導紅番茄果實，4 種單糖誘導紅番茄果實后硬度與對照組無顯著性差異，排除了果膠組分中單糖差異對于紅番茄果實硬度不同的影響。

2.2 OGs 誘導后紅番茄果實細胞壁降解相關基因表達分析

OGs 誘導后紅番茄果實細胞壁降解相關基因SlPL3、SlPG2、SlPL5 表達情況見圖4。

圖4 OGs 誘導后紅番茄不同時間SlPL3、SlPG2、SlPL5 基因表達Fig.4 Effect of OGs induction on expression of SlPL3，SlPG2，and SlPL5 of tomato at different time

硬度是果實品質的重要性狀，與果實質地和保質期相關。研究顯示，番茄PL 與PG 基因家族的表達模式與果實硬度緊密相關。成熟紅番茄果實中SlPG2a 基因的表達豐度占果皮總mRNA 的1%，沉默該基因表達能夠抑制果實軟化，是番茄中第一個商業化應用的“保鮮”基因[20]。反義PL 基因番茄果實的軟化也會受到抑制，果實甲酯化的半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonans，HGs）裂解減少，在不影響其他成熟品質指標的情況下，能夠延長貨架期[4]。如圖4 所示，紅番茄果實SlPG2、SlPL3 和SlPL5 的表達豐度在OGs 處理后受到抑制。OGs 處理后3 個基因的表達下調明顯，在處理后第2、3、5 天SlPL3 基因相對表達量均低于對照組。紅番茄SlPL5 基因相對表達量在OGs 處理后第1、2、5 天均低于對照組。紅番茄SlPG2 基因相對表達量在OGs處理后第2、3、5 天均低于對照組。由此可知，OGs 處理后紅番茄果實中3 種與果實軟化密切相關的細胞壁降解基因表達受到抑制，可能延緩成熟番茄果實的軟化進程。

2.3 OGs 誘導對漿果類果實軟化的影響

OGs 誘導對漿果類果實硬度的影響如圖5 所示。

圖5 OGs 對3 種漿果果實硬度的影響Fig.5 Effect of OGs on firmness of three berries

由圖5 可知，使用10 mg/mL OGs 分別浸泡紅提葡萄、藍莓、草莓3 種典型大宗漿果類果實。在貯藏期間，3 種漿果果實硬度整體呈下降趨勢，果實貯藏至第7天時，OGs 處理組紅提葡萄、藍莓、草莓硬度分別高出對照組38.22%、37.48%、69.87%。OGs 處理可以很好地減緩貯藏期間果實的軟化，維持果實硬度，很大程度上對果實起保護作用，以上結果也意味著OGs 的應用有利于改善果實采后的貯運過程中果實極易因機械損傷、微生物侵染等原因造成品質快速劣變的情況。OGs 誘導處理后紅提葡萄、藍莓、草莓3 種漿果類果實的軟化均有所減緩，證明OGs 具有適用于減緩多種漿果類果實軟化的潛力。

2.4 OGs 誘導對漿果類果實腐爛率、可溶性固形物的影響

OGs 誘導對漿果類果實腐爛率、可溶性固形物含量的影響見圖6。

圖6 OGs 對3 種漿果腐爛率和可溶性固形物含量的影響Fig.6 Effect of OGs on decay rate and soluble solid content ofthree berries

果實采摘及運輸過程中，因機械損傷等原因造成果實表面的破損瘀傷以及瘀傷后嚴重軟化的果實和受到病原菌侵染的果實均被視為損失果實，漿果類果實的高含水量與高營養價值，使其極易受到損傷，同時給微生物繁殖提供了很好的場所，果實的采后損傷也會直接導致果實的品質劣變[21-22]。由圖6A、B、C 可知，在處理后第7 天OGs 處理組紅提葡萄、藍莓、草莓腐爛率分別較對照組降低了66.67%、63.61%、47.06%，經OGs 處理可以降低果實貯藏期間的腐爛率。

果實中的可溶性固形物包含組織中糖、酸、微量元素以及果實漿質等物質，通過折射系數反映[23]，可溶性固形物含量也能比較直觀地反映出果實的品質，但在貯藏期間，可溶性固形物含量呈現出一種波動性。由圖6D、E、F 可知，3 種漿果類果實在貯藏期間可溶性固形物含量整體呈上升趨勢，其中紅提葡萄、藍莓組中OGs 處理組可溶性固形物含量高于對照組，而草莓組中OGs 處理組可溶性固形物含量較對照組降低?？紤]可能是由果實種類差異、貯期間果實成熟度不一致、果實自身耐儲性等原因造成的。

3 結論

本研究從不同來源果膠制得的OGs 影響果實軟化的效果、影響果實軟化的分子機制及在漿果果實上的應用3 個方面探究OGs 對漿果果實軟化的影響。結果表明，造成不同來源果膠制得的OGs 減緩果實軟化效果差異的主要原因是OGs 的聚合度，保留時間在14 min 以內的OGs 生物活性更高。OGs 通過抑制紅番茄果實細胞壁降解相關基因SlPG2、SlPL3、SlPL5 的表達實現減緩成熟番茄果實軟化的目的，且OGs 減緩果實軟化的作用在藍莓、草莓和紅提葡萄中同樣適用，表明OGs 可以有效抑制果實采后品質劣變。本文為研發和提升新鮮果蔬產品采后生理及病理劣變防治技術奠定基礎，為果蔬保鮮提供技術新思路。