氯化鈣處理對采后百香果細胞壁物質代謝的影響

潘家麗，陳舒柔，李木火，許華根，覃子倚，李靜，李霞，董新紅

（桂林理工大學 化學與生物工程學院 廣西電磁化學功能物質重點實驗室，廣西 桂林 541004）

百香果（Passiflora edulia）屬于西番蓮科西番蓮屬，常生長于熱帶地區[1]。百香果營養豐富，富含維生素、礦物質、黃酮類及三萜類化合物，其果汁香濃，被稱為“果汁之王”，深受消費者喜愛[2]。百香果是一種典型的呼吸躍變型水果，其成熟過程涉及色澤、硬度、細胞壁降解等生理變化，果實達到呼吸躍變高峰后便會軟化皺縮，果皮色澤由光亮明艷變為灰暗無光[3]。細胞壁主要由果膠、纖維素、半纖維素等多糖類物質構成，是果實維持硬度的重要條件，其中果膠物質與纖維素交叉聯接，起支撐作用，決定著果實細胞的形態與結構[4]。細胞壁降解不僅會導致果實質地軟化，還會發生果皮皺縮和色彩飽和度降低的現象，直接影響果實的口感與外觀，甚至會導致果實腐爛，不利于加工利用。因此，如何減緩百香果果實軟化、保持果實采后生理品質是亟需解決的問題。

鈣是植物細胞壁的重要組成部分，積極參與細胞壁結構的形成，維持細胞膜結構和功能的完整性[5]。采后鈣處理可以使鈣離子（Ca2+）與細胞壁中的果膠結合，提高細胞壁的剛性與支撐力，保持果實硬度[6]。CaCl2無毒、無臭、味微苦，是果實采后鈣處理常用的試劑。研究表明，CaCl2處理可以抑制貯藏過程中冬棗[7]、番木瓜[8]、南果梨[9]硬度的下降，延緩細胞壁代謝相關酶活性的升高，對保持果實營養物質和果實品質起積極作用。Manganaris 等[10]發現，CaCl2處理可以抑制采后桃果實原果膠的降解，減緩水溶性果膠含量的增加，維持果實細胞壁完整。孫文文等[11]發現，CaCl2處理可延緩采后甜柿在貯藏期間的硬度、色差的下降，抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活性的升高，保持甜柿堅硬，提高貯藏品質。趙臨強等[12]發現，采用不同濃度的鈣處理均能抑制鮮切蘋果的軟化，提高其抗氧化活性，延緩鮮切蘋果的品質劣變。目前關于采后百香果細胞壁的研究主要集中于對果實自身細胞壁多糖成分[13]和果膠提取率[14]，而外源處理百香果并從細胞壁代謝角度分析百香果衰老軟化的研究鮮見。本文以百香果為試驗材料，通過研究采后CaCl2處理對百香果果實衰老過程中細胞壁代謝的影響，探討細胞壁代謝在百香果衰老過程中的作用，為進一步研究百香果采后品質的保持提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果采摘于廣西萬禾農業開發集團有限公司百香果種植基地，挑選形狀圓潤、色澤均一、無機械損傷及病蟲、成熟度相近的果實進行試驗。

氯化鈣、乙二胺四乙酸、無水碳酸鈉、乙酸鈉、無水乙醇、濃硫酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；氯化鈉、氫氧化鉀、咔唑、蒽酮（均為分析純）、果膠（74%）、3，5-二硝基水楊酸（99%）：上海易恩化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Universal TA 質構儀：上海騰拔儀器有限公司；722PC 可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；Nr145 電腦色差儀：廈門億恩達科技有限公司；3-30K高速冷凍離心機：德國Sigma 公司；DZF-6020 真空干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將220 個百香果果實分為2 組，一組以清水處理5 min作為對照（control check，CK），另一組以5% CaCl2溶液浸泡5 min。果實處理后晾干裝入40 cm×30 cm、厚0.11 mm 的塑料袋中（10 個果實/袋、11 袋/處理組），在室溫（22±1）℃下貯藏，每隔2 d 從各組中選取10 個百香果果實測定硬度和色澤，然后將整果果皮用液氮粉碎，置于-80 ℃貯藏，用于后續細胞壁物質含量和細胞壁代謝相關酶活性等指標的測定。所有試驗均設計3 個重復，結果取平均值。

1.3.2 硬度的測定

用質構儀測定果實赤道部分的硬度，選用P50 柱形探頭，測試類型為下壓，目標模式為形變，目標值為10%，停留時間為2 s，測試前速度為1 mm/s，測試速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，感應力為6 g。

1.3.3 色澤的測定

色澤參考Chu 等[15]的方法進行測定。采用電腦色差儀測定果皮顏色，記錄測定的L*值、b*值、c*值和h*值。依次在果實的正面、側面、反面測定3 個點。

1.3.4 細胞壁組分的測定

細胞壁物質提取參考Qi 等[16]的方法，取5 g 果皮粉末加入25 mL 乙醇煮沸20 min，冷卻后10 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復此步驟2 遍。用體積比為1∶1 的氯仿和甲醇溶液浸泡5 min 后用丙酮沖洗，將得到的白色粉末狀固體置于真空干燥箱中干燥3 d，以去離子水、50 mmol/L 乙二胺四乙酸和50 mmol/L 碳酸鈉依次提取水溶性果膠、離子型果膠、共價結合型果膠，以4%和24%氫氧化鉀提取半纖維素，分別得到松散型半纖維素（4KSF）、緊密型半纖維素（24KSF）。參考何俊瑜等[17]的咔唑法測定果膠含量，吸取1 mL 提取液加入試管，加入6 mL 濃硫酸，沸水浴20 min，冷卻后加入0.2 mL 1.5 g/L 咔唑乙醇溶液，測定反應液在530 nm 處的吸光度。用蒽酮法[18]測定半纖維素含量，取0.5 mL上清液和1.5 mL 蒸餾水加入25 mL 試管中，然后加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL 濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管準確保溫1 min，取出后自然冷卻至室溫，測定630 nm 處的吸光度。

1.3.5 細胞壁代謝相關酶活性的測定

PG 活性參考何嘉琪等[19]的方法測定。稱取2 g 百香果果皮粉末，加入20 mL 95%乙醇，低溫（4 ℃）放置10 min，于4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，加入15 mL 80%乙醇，同條件離心，再移去上清液后加入10 mL 提取緩沖液（含1.8 mol/L 氯化鈉），離心后取上清液即為酶液。分別取0.5 mL 上清液和0.5 mL 煮沸5 min 的上清液置于25 mL 具塞刻度試管中，分別依次加入1 mL 乙酸鹽緩沖液（50 mmol/L、pH5.5）和0.5 mL多聚半乳糖醛酸溶液，于37 ℃水浴1 h 后，加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，再沸水浴加熱5 min，迅速冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至25 mL，測定540 nm 處的吸光度。以每小時每克果蔬組織樣品在37 ℃催化多聚半乳糖醛酸水解成半乳糖醛酸的質量表示PG 活性[μg/（h·g）]。

PME 活性測定參考郭欣等[20]的方法，略有改動。酶液提取方法同上，取0.5 mL 酶液，加入0.5 mL 10 g/L果膠溶液和1 mL 乙酸鹽緩沖液（50 mmol/L、pH5.5）混合均勻，余下步驟同PG 活性的測定方法。以每小時每克果蔬組織樣品在37 ℃催化果膠水解成半乳糖醛酸的質量表示PME 活性[μg/（h·g）]。

1.4 數據處理

采用SPSS 25 軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA）檢驗；采用Origin 8.5 軟件進行繪圖，P<0.05、P<0.01 分別表示差異顯著、極顯著。

2 結果與分析

2.1 CaCl2 處理對百香果果實硬度的影響

CaCl2處理對百香果果實硬度的影響見圖1。

圖1 CaCl2 處理對百香果果實硬度的影響Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on firmness of Passiflora edulia

由圖1 可知，隨著貯藏時間的延長，百香果的硬度整體呈下降趨勢，且在整個貯藏期間，經CaCl2處理的果實硬度始終高于CK 組，貯藏至第4、6、8 天時，CaCl2處理組硬度比CK 組硬度分別高20.09%、20.73%和13.61%，說明CaCl2處理可以明顯延緩百香果果實硬度下降，減緩果實的軟化，可能是經過CaCl2浸泡后提高了百香果果實的鈣含量，使細胞壁更加穩固，保持了百香果的硬度。

百香果貯藏期間外觀變化見圖2。

圖2 百香果貯藏期間外觀變化Fig.2 Appearance changes of Passiflora edulia during storage

由圖2 可知，隨著貯藏時間的延長，對照組百香果的皺縮程度明顯高于CaCl2處理組。貯藏4 d 時，對照組的果皮已發生明顯皺縮，而CaCl2處理組果皮仍光滑平整；8 d 時，對照組百香果果皮表面凹凸不平，裂痕明顯，果皮褐變嚴重，黯淡無光，CaCl2處理組出現輕微皺縮，果皮顏色保持紫紅色，表明CaCl2處理能抑制采后百香果的外觀惡化，維持果實良好的商業品質。

2.2 CaCl2 處理對百香果果皮色澤的影響

CaCl2處理對百香果果皮色澤的影響如圖3 所示。

圖3 CaCl2 處理對百香果果皮色澤的影響Fig.3 Effect of CaCl2 treatment on color of Passiflora edulia peel

L*值代表亮度，如圖3A 所示，在貯藏期間，果皮的L*值整體呈先下降后上升的趨勢，貯藏至第8 天時，CaCl2處理組的L* 值較CK 組極顯著升高了10.67%（P<0.01）。b*值表示色彩飽和度，如圖3B 所示，貯藏至第8 天時，CaCl2處理組的b*值較CK 組極顯著升高了47.37%（P<0.01）。c*值表示飽和度，如圖3C 所示，CK 組和CaCl2處理組的c*值均在第2 天達到最高值，然后下降，在整個貯藏期間，CaCl2處理組的c*值明顯高于CK 組。h*值表示色調，如圖3D 所示，貯藏至第8 天時，CaCl2處理組的h*值較CK 組極顯著升高了40.26%（P<0.01）。綜上，在貯藏期間，CaCl2處理能明顯提高百香果的L*值、b*值、c*值、h*值，減緩百香果色度的降低，保持果皮鮮亮。

2.3 CaCl2 處理對百香果果皮細胞壁物質降解的影響

2.3.1 CaCl2處理對百香果果皮不同果膠含量的影響

CaCl2處理對百香果果皮水溶性果膠（water soluble pectin，WSP）含量、離子型果膠（ionic bound pectin，ISP）含量、共價結合型果膠（covalently bound pectin，SCSP）含量的影響見圖4。

圖4 CaCl2 處理對百香果果皮果膠含量的影響Fig.4 Effect of CaCl2 treatment on pectin content of Passiflora edulia peel

由圖4A 可知，貯藏過程中，CaCl2處理組和CK 組果皮WSP 含量整體呈上升趨勢，CK 組WSP 含量在第0～6 天迅速上升并在第6 天達到峰值，貯藏至第8 天輕微下降，而CaCl2處理組的WSP 含量在貯藏第4 天時下降，隨后又穩定上升，貯藏第8 天時，CaCl2處理組WSP 含量較CK 組顯著降低了14.40%（P<0.05）。

由圖4B 可知，ISP 含量變化規律與WSP 相似，整體呈上升趨勢，CaCl2處理組的ISP 含量始終低于CK組。貯藏前期，兩組的ISP 含量無顯著差異（P>0.05），貯藏4 d 時，CK 組ISP 含量迅速升高，6 d 時略有下降，之后又迅速上升，而CaCl2處理組貯藏0～4 d 時ISP 含量比較穩定，貯藏后期ISP 含量逐步上升，貯藏8 d 時ISP 含量顯著低于CK 組（P<0.05），較CK 組低17.56%。

由圖4C 可知，CK 組的SCSP 含量呈先下降后上升的趨勢，SCSP 貯藏至第4 天時含量最低，然后緩慢上升并趨于穩定，而CaCl2處理組的SCSP 含量則呈先上升后下降再上升的趨勢，貯藏2～4 d 時，CaCl2處理組SCSP 含量始終明顯高于CK 組，可能是適當的CaCl2處理促使果膠與Ca2+更好的結合，抑制了果膠水解酶的活性，從而減緩了水溶性果膠的上升，抑制了非水溶性果膠的降解。

2.3.2 CaCl2處理對百香果半纖維素（4KSF、24KSF）含量的影響

CaCl2處理對百香果半纖維素4KSF 含量、24KSF含量的影響見圖5。

圖5 CaCl2 處理對百香果果皮4KSF 含量、24KSF 含量的影響Fig.5 Effect of CaCl2 treatment on 4KSF content and 24KSF content of Passiflora edulia peel

由圖5A 可知，CK 組中半纖維素4KSF 含量整體呈先上升后下降的趨勢，4KSF 含量貯藏至第2 天時迅速上升并達到最高值，然后緩慢下降。CaCl2處理組4KSF 含量呈先上升后下降再上升的趨勢，貯藏第4 天時達到峰值，并且貯藏第6～8 天時，4KSF 含量極顯著低于CK組（P<0.01），較CK 組分別降低了24.30%、11.89%。

由圖5B 可知，24KSF 含量整體呈下降趨勢，CK組的24KSF 含量貯藏至第2 天時急劇下降，貯藏2～6 d時24KSF 含量略有上升，貯藏至第8 天時又迅速下降，較0 d 時下降了30.95%，可能是采后百香果在貯藏期間乙烯含量增加，呼吸速率加強，導致細胞壁成分解聚，而CaCl2處理組的24KSF 含量在貯藏期間處于較穩定狀態，且始終高于CK 組，貯藏至第8 天時，24KSF 含量較CK 組高了25.16%。

2.4 CaCl2 處理對百香果果皮細胞壁相關代謝酶的影響

CaCl2處理對百香果果皮細胞壁相關代謝酶的影響見圖6。

由圖6A 可知，整個貯藏期間，CaCl2處理組和CK組的百香果果皮PG 活性整體呈先上升后下降再上升的趨勢，在貯藏過程中，CaCl2處理組的PG 活性始終低于CK 組，貯藏至第8 天時，PG 活性均達到最大，但CaCl2處理組的PG 活性較CK 組極顯著降低25.74%（P<0.01）。

由圖6B 可知，CK 組、CaCl2處理組的PME 活性總體呈先上升后下降的趨勢，均在第4 天活性達到峰值，分別為1 606.51、1 355.39 μg/（h·g），CaCl2處理組PME活性顯著低于CK 組（P<0.05），較CK 組降低15.63%，說明CaCl2處理能有效延緩百香果果皮PME 活性的升高，降低活性峰值，原因可能是在PME 的作用下，外源鈣會結合果膠分子在百香果成熟過程中去酯化產生的負電荷，加固細胞結構，使細胞壁水解酶不易水解細胞壁，保持百香果果實的堅硬[21]。

2.5 相關性分析

百香果各指標相關性分析結果如表1 所示。

表1 各指標間的相關性分析Table 1 Correlation analysis between various physiological indicators

由表1 可知，百香果的硬度和L*值、b*值、c*值、h* 值呈極顯著正相關（r=0.895，r=0.594，r=0.660，r=0.614，P<0.01），這反映了百香果硬度與色差的關系；百香果硬度與24KSF 含量呈極顯著正相關（r=0.698，P<0.01），與WSP 含量、ISP 含量、PG 活性、PME 活性呈極顯著負相關（r=-0.729，r=-0.794，r=-0.612，r=-0.548，P<0.01），這反映了百香果硬度與細胞壁代謝的關系，說明百香果硬度下降、果實軟化是一個細胞壁物質降解和細胞壁代謝相關酶活躍的過程。L*值與b*值、c*值、h*值之間均呈極顯著正相關（r=0.798，r=0.667，r=0.810，P<0.01），說明4 個關于百香果色澤指標相互間關系較大，對采后百香果外觀變化起協同作用。L*值、b*值、h*值與WSP 含量、ISP 含量、4KSF 含量、PG 活性、PME 活性之間呈極顯著負相關（P<0.01），與24KSF含量呈極顯著正相關（P<0.01），這反映了百香果色澤與細胞壁代謝的關系，說明采后百香果細胞壁物質代謝越快，果皮外觀色澤越差。

2.6 主成分分析

對百香果貯藏期間的12 個生理生化指標進行主成分分析得到12 個主成分的特征值、方差貢獻率和累積方差貢獻率，結果見表2。

表2 百香果貯藏期間12 個生理指標的主成分分析Table 2 Principal component analysis of 12 indexes from Passiflora edulia during storage time

由表2 可知，特征值大于1 的共有3 個成分，3 個成分累積方差貢獻率為82.266%，能代表百香果果實生理指標的大部分信息，因此選用這3 個成分代表百香果的主要品質。百香果果實硬度、L* 值、b* 值、c*值、h*值、WSP 含量、ISP 含量、24KSF 含量、PG 活性、PME 活性在PC1 上載荷最高，說明第一主成分主要反映了這10 個成分指標的信息，其中硬度、L*值、b*值、c*值、h*值、24KSF 含量在正坐標處有較高載荷，WSP含量、ISP 含量、PG 活性、PME 活性在負坐標處具有較高載荷。4KSF 含量在PC2 上載荷最高，說明第二主成分反映了該成分指標的信息。SCSP 含量在PC3 上的正坐標處有較高載荷，說明第三主成分主要反映了該成分指標的信息。在成分矩陣中，載荷絕對值反映了對主成分貢獻率的大小，絕對值越大，則貢獻率也越大，PC1 中貢獻率大小為L* 值>b* 值>h* 值>硬度>WSP 含量>24KSF 含量>PME 活性>ISP 含量>PG 活性>c*值。

以各因子得分FAC1、FAC2、FAC3 所對應的特征值為權數，與該因子得分相乘可得出主成分得分，根據主成分得分計算百香果貯藏期間品質的綜合得分，結果見圖7。

圖7 CaCl2 處理對百香果綜合品質的影響Fig.7 Effect of CaCl2 treatment on comprehensive quality of Passiflora edulia

由圖7 可知，常溫貯藏期間內，綜合得分逐漸降低，即百香果的貯藏品質在不斷下降，在整個貯藏期間，CaCl2處理組百香果綜合得分均高于對照組，說明CaCl2處理能抑制百香果細胞壁物質降解，減緩果實硬度的下降速率，維持百香果的采后貯藏品質。

3 討論與結論

果實在成熟軟化過程中發生的細胞壁降解可分為果膠物質降解和半纖維素降解[22]。WSP、ISP、SCSP 等果膠物質是初生細胞壁和中層細胞壁的重要構成之一，也是植物組織中果膠多糖和其他細胞壁成分的主要材料，其結構的改變與果實硬度變化有著極為重要的關系[23]。果實在成熟軟化前，細胞壁的主要形式為水不溶性果膠，此時細胞壁完整，果實堅硬，隨著果實軟化，水不溶性果膠不斷降解，同時產生大量水溶性果膠，細胞解體，果實衰老[24]。半纖維素的降解會增大細胞壁空隙，導致細胞壁結構的松散，加快水解酶的擴散。研究證明，果實軟化過程伴隨著緊密型半纖維素（24KSF）向松散型半纖維素（4KSF）降解轉化[25]。硬度的大小和色澤不僅能直觀反映百香果的品質，而且是評定百香果果實商品性的重要指標。本研究結果表明，貯藏至第8 天時，CaCl2處理組百香果的硬度和24KSF 含量較CK 組分別高13.61%、25.16%，WSP 含量、ISP 含量較CK 組降低了14.40%、17.56%，同時抑制了4KSF 含量的上升，減緩了SCSP 含量的降解，維持較高的L*值、b*值、c*值、h*值，保持細胞壁的完整性，使貯藏期內的果皮維持較高硬度。相關性分析結果表明，百香果硬度與24KSF 含量呈極顯著正相關（P<0.01），與WSP 含量、ISP 含量呈極顯著負相關（P<0.01），說明百香果硬度越低，WSP 含量、ISP 含量越高，24KSF 含量越低，即百香果的軟化與細胞壁組成成分有著重要聯系。

果實軟化過程中伴隨著細胞中膠層結構的改變，這種改變會促進細胞壁物質的降解，而包括PG、PME、纖維素酶、β-半乳糖苷酶等在內的細胞壁降解酶是導致細胞壁成分降解和果實軟化的主要因素，尤其是PG和PME[26]。Lin 等[27]研究發現PG 和PME 的聯合作用可以破壞果膠中層結構，降低果實軟化過程中細胞壁的凝聚力。本研究結果表明，CaCl2處理能降低PG 和PME活性，有效延緩由于果皮細胞壁結構降解而導致的果皮損傷，有利于維持百香果果實的貯藏品質。相關性結果表明，PG、PME 活性與WSP、ISP 含量呈極顯著正相關，與硬度、24KSF 含量呈極顯著負相關（P<0.01），PG 活性與4KSF 含量呈顯著正相關（P<0.05），PME 活性與4KSF 含量呈極顯著正相關（P<0.01），說明PG、PME 在果實軟化過程起重要作用。

綜上所述，CaCl2處理在抑制百香果細胞壁代謝，延長果實貨架期，延緩果皮軟化皺縮方面發揮著重要作用。