海洋放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 的抑菌活性及抑菌物質鑒定

許慧敏，成穎，崔萌菲，王依婷，李居行，肖逸飛，李貞景，郭慶彬，劉歡歡

（天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457）

海洋放線菌是一個龐大的群體，不僅能應對高鹽、高壓、低溫、低氧等極端環境，還具備一些獨特的生理生化特征。為了適應海洋的極端環境，海洋放線菌往往會進化出獨特的基因型以及代謝途徑，還會產生結構新穎、功能多樣的生物活性成分，這些獨特功能賦予了海洋放線菌的多樣性和復雜性，為各種酶及代謝產物的發掘提供了天然的篩選寶庫[1-2]。

擬諾卡氏菌（Nocardiopsis）是海洋放線菌中一類較為重要的微生物資源，具有生產多種天然生物活性產物的能力，在農業、食品、環境等領域有較大的應用潛力。Nocardiopsis 為革蘭氏陽性菌，該菌株需氧，耐鹽不耐酸，過氧化氫酶陽性，且產生擬諾卡菌型菌絲體，其氣生菌絲體帶有長鏈孢子[3]，除海洋環境外，Nocardiopsis還可附生或內生于陸地植物中[4]。總結有關Nocardiopsis的文獻，發現它可產生具有多種生物活性的化合物，特別是各種酶類，如幾丁質酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、菊粉酶、激酶，具有潛在的農業價值和食品工業應用價值[5]。此外，它還可產生多種次級代謝產物，如聚酮化合物、環肽、大環內酯類、二酮哌嗪、α-吡喃酮、γ-吡喃酮、生物堿、萘醌、P-糖蛋白抑制劑、吩嗪和吩惡嗪衍生物，這些次級代謝產物具有廣泛的藥理和生物學作用，主要為抗菌、抗癌、抗腫瘤、免疫調節和抑制蛋白激酶等[6-7]，在生物醫藥與健康產業領域具有較大的應用潛力。

Nocardiopsis 菌株的分離鑒定及抑菌活性研究是目前該菌屬研究的一個重點。由于其耐鹽、耐堿和耐干燥的特性，使它們在陸地、室內、海洋生態系統和高鹽度棲息地中均具有不同程度的適應性，因而從不同生態位中獲得的Nocardiopsis 分離株的抑菌特性存在顯著差異。Gopal 等[8]從河南汝南鎮牧場健康山羊糞便中分離出Nocardiopsis 菌屬，其對細菌和真菌病原體（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、尖孢鐮刀菌和綠色木霉）具有較強的抑制活性。Schumacher 等[9]從夏威夷考艾島淺水沉積物樣品中獲得一株N.dassonvillei，經純化分離得到兩種新型吲哚核苷kahakamides A，它們對枯草芽孢桿菌具有抑菌活性。Leutou 等[10]從海洋放線菌Nocardiopsis sp.CNQ-115中分離到一種新的十四元環的內酰胺類天然產物fluvirucin B6，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制活性。海綿來源的N.dassonvillei MAD08，其發酵提取物對多重耐藥病原菌的抑菌活性為100%，從其發酵上清液的粗提物分離得到11 種抗菌化合物，同時包括脂溶性和水溶性抗菌化合物[11]。土壤來源的Nocardiopsis sp.MK_MSt033 可分泌18 種抗菌物質，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有顯著的抑制效果[12]。

對抑菌活性物質的分離鑒定是天然產物發掘的關鍵環節，然而僅利用傳統的分離分析方法獲取新的天然產物已經無法滿足發掘需求。隨著高通量測序和信息技術的發展，微生物基因組測序數據呈指數增長，各類次級代謝產物基因簇數據庫變得越來越豐富可用，為新的次級代謝天然產物的發現和研究提供了有力的幫助[13]?；蚪M挖掘通過分析基因組序列從而預測合成基因，進一步篩選具有特定功能的基因或基因簇[14]，根據編碼蛋白的功能來預測合成產物的結構，最終通過分析預測結構尋找化合物，并進行結構鑒定[15]。其中，antiSMASH 是通過基因組預測次級代謝產物合成基因簇最常用的工具，基于核心保守基因序列，antiSMASH 可以預測基因簇類型[16]，還可以對輔助基因進行注釋和分組，將代謝物核心結構最小化，使研究者能夠快速識別基因組中的生物合成基因簇[17]。目前，基于基因組測序的代謝產物發掘技術已經成為研究新型先導藥物的重要組成部分，在天然產物研究中發揮越來越大的作用。

基于上述背景，本研究將對實驗室分離的一株海洋放線菌進行鑒別，通過對同源物種的基因組進行次級代謝產物合成基因簇的挖掘，并聯合液相色譜-質譜聯用技術[18]，對潛在的抑菌活性物質進行推斷，以期為Nocardiopsis 菌屬的抑制活性物質發掘及機制研究提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

海洋放線菌（Nocardiopsis sp.HM-01）：分離于天津大港鹽湖鹵水；大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、假單胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus CICC 21617）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum ATCC 19264）、哈維式弧菌（Vibrio harveyi ATCC 33842）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae ATCC 700323）：保藏于天津科技大學食品科學與工程學院發酵食品與新資源開發研究室。

Nocardiopsis sp.HM-01 培養基為1）搖瓶種子培養基（g/L）:可溶性淀粉10 g，葡萄糖5 g，酵母粉7 g，蛋白胨7 g，NaCl 3 g，KNO33 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，CaCO31 g，黃豆粉20 g，初始pH 值為7. 0；2）搖瓶發酵（RP）培養基（g/L）：葡萄糖30 g，可溶性淀粉10 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨3 g，黃豆粉35 g，CaCO33.5 g，初始pH 值為7. 0；3）搖瓶發酵（international Streptomyces project medium No.2，ISP2）培養基：不調節pH 值。

指示菌培養基為LB（Luria-Bertani）培養基（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、假單胞菌、陰溝腸桿菌適用）和2216E 培養基[19]（副溶血弧菌、鰻弧菌、哈維式弧菌適用）。

上述培養基滅菌條件均為0.1 MPa、121 ℃、30 min。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀（HPLC 1200）、紫外分光光計（Agilent 8453）：美國安捷倫科技有限公司；振蕩培養箱（ZQWY-200N）：上海知楚儀器有限公司；酶標儀（Infinite 200PRO）：瑞士Tecan 公司；倒置熒光顯微鏡（EVOS）、掃描電子顯微鏡（FEI Apreo）：美國Thermo Fisher Scientific 公司；超高效液相色譜儀（Nexera 30A）：日本島津公司；三重四極桿質譜儀（AB SCIEX TripleTOF 6600）：美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 形態學觀察、菌株鑒定和培養

1.3.1.1 菌種制備

將-80 ℃保藏的孢子懸液，取10 μL 涂布于RP 固體培養基上，于28 ℃恒溫培養箱培養5～7 d，獲得新鮮孢子。輕刮一接種環孢子加到100 mL 液體種子培養基中，28 ℃、220 r/min 下培養2 d，獲得種子液。按10%比例接種到液體發酵培養基中，于28 ℃、180 r/min 下培養9～15 d，獲得發酵液進行后續測試。

1.3.1.2 形態學觀察及菌株鑒定

在RP 固體平板上用劃線稀釋法活化Nocardiopsis sp.HM-01 菌株，觀察平板表面形成的菌落形態，通過倒置熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株的微觀形態。倒置熒光顯微鏡制片及操作參考余濟源[20]的方法。掃描電鏡樣品的制片參考范麗霞[21]的方法，將處理好的樣品真空冷凍干燥，取樣均勻粘涂在碳導膠帶上，噴金后在掃描電鏡下觀察菌絲體和孢子的形態。

菌株16S rDNA 序列的提取[22]及測序[13]方法：挑取對數生長期菌落，采用酚-氯仿法進行抽提，氯仿-異戊醇洗脫，乙醇沉淀，三（羥甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸 [tris（hydroxymethyl）aminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid，Tris-EDTA] 緩沖液重懸，-20 ℃進行保存。經測序后，通過NCBI blast 程序，對菌株16S rDNA 序列進行比對，確定目標菌株的種屬特性。之后根據序列同源性選取典型菌株的16S rDNA 序列，在MEGA 7.0 軟件中，采用Neighbor-Joining 法構建系統發育樹。

1.3.2 抑菌活性的測定

抑菌樣品制備[23]：取發酵液加入等體積乙酸乙酯萃取3 次，用高速離心機（4 000 r/min，20 min）進行固液分離，收集有機相經氮吹濃縮得到浸膏，加入1 mL甲醇溶解，存放于4 ℃冰箱，以備后續試驗。

抑菌活性測定方法：RP、ISP2 液體發酵培養基分別培養Nocardiopsis sp.HM-01，每24 h 取樣1 次，經處理獲得抑菌樣品，以革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）為指示菌進行抑菌試驗，抑菌樣品測定放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 對指示菌的抑菌圈直徑（打孔法[24]）。以時間為橫坐標，抑菌圈直徑為縱坐標繪制生物活性曲線。

抑菌譜測定：采用打孔法[24]，將供試細菌接種至LB 培養基（10 mL），在37 ℃、180 r/min 條件下培養10～12 h，測菌液OD600nm，用無菌水將菌液稀釋至1×106cfu/mL，吸取100 μL 菌液均勻涂布于LB 固體培養基，晾干后在涂布有測試菌的培養皿上打孔，加入過膜抑菌樣品50 μL，37 ℃培養24 h 后測定抑菌圈直徑，以等體積甲醇作為陰性對照組。

1.3.3 潛在次級代謝產物基因簇的鑒定

選取Nocardiopsis sp.HM-01 的近緣基因組序列（NCBI Assembly 數據庫中的N.dassonvillei，N.albirubida 及N.synnemataformans 的基因組組裝序列），首先利用Ubuntu-linux 本地化的Prokka 軟件[25]對其進行全基因組注釋，之后采用antiSMASH 軟件對次級代謝生物合成基因簇進行預測，選取相似度高于70%的基因簇進行代謝產物推測及液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）檢測。

1.3.4 抑菌產物鑒定

將發酵液分別用乙酸乙酯萃取3 次，乙酸乙酯相經氮吹濃縮后得到浸膏，取1 mL 甲醇定量溶解。使用超高效液相色譜系統和質譜儀對抑菌樣品進行LCMS 分析。

高效液相色譜條件：采用ZIC-HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）對代謝物進行鑒定。以10 mmol/L 醋酸銨和100%乙腈為流動相A 和B，流速為0.2 mL/min，洗脫梯度：0～3 min，90%B；3～6 min，90%～60%B；6～25 min，60%～50%B；25～30 min，50%B；30～30.5 min，50%～90%B；30.5～38 min，90%B。

質譜條件：電噴霧電離源負離子模式，離子電壓4 500 V；去簇電壓80 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓0.24 MPa；霧化氣壓0.38 MPa；加熱器氣壓0.38 MPa。每個掃描周期包括1 次飛行時間質譜（time of flightmass spectrometry，TOF-MS）全掃描和15 次二級質譜掃描。TOF-MS 的質量范圍設定為m/z 63～1 000，二級質譜的質量范圍為m/z 30～1 000，樣品進樣體積為3 μL。

1.4 數據統計

研究中涉及的抑菌試驗至少重復3 次以上，并采用Origin 2021 對數據進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察和菌株鑒定

Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形態學觀察結果見圖1。

圖1 Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形態學觀察Fig.1 Morphological observation of strain Nocardiopsis sp.HM-01

如圖1 所示，海洋放線菌Nocardiopsis sp.HM-01在RP 培養基上，整體呈中間凹陷、邊緣凸起的絨毛放線狀。顏色整體為淡黃色，邊緣為乳白色。將處理好的樣品在掃描電鏡下觀察，發現放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 菌絲以橫隔分裂方式形成孢子鏈，孢子呈橢圓形桿狀，表面光滑，形態飽滿，符合Nocardiopsis 菌屬的孢子形態。在電子顯微鏡下，Nocardiopsis sp.HM-01菌絲體呈長絲，有橫隔，大多數菌絲斷裂成長短近于一致的桿狀孢子，每個桿狀體內至少有一個核，可復制并形成新的多核菌絲體，是典型的擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）的菌絲形態[26-28]。

提取菌株Nocardiopsis sp.HM-01 的總DNA 及進行16S rDNA 的擴增，并進行測序分析，將其在NCBI數據庫中進行Blast 檢索，選取親緣性較高的典型菌株序列進行系統發育分析，結果見圖2。

圖2 基于16S rDNA 序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

由圖2 可知，菌株Nocardiopsis sp.HM-01 與N.alborubida NBRC 13392、N.dassonvillei IFO 14626 和N.synnemataformans DSM 44143 聚在同一分支，親緣性最高，且自展值大于0.95。因此，綜合該放線菌在形態培養特征及16S rDNA 系統發育分類學的分析，確認該菌株為擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）。

2.2 放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 的抑菌活性研究結果

在放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 培養過程中，每隔24 h 取樣，測定經乙酸乙酯提取的抑菌樣品對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑制效果，測定結果如圖3 和圖4 所示。

圖3 不同時間Nocardiopsis sp.HM-01 發酵提取液對細菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on bacteria at different time

圖4 Nocardiopsis sp.HM-01 對革蘭氏菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on tested bacteria

由圖3 可知，隨著放線菌Nocardiopsis sp.HM-01培養時間的延長（5～9 d），其抑菌作用也逐漸增強，在9 d 時達到最高，之后有下降趨勢，但仍維持在較高水平，表明放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 產生抑菌活性物質是在其對數生長末期開始進入較高水平。由圖4可知，由RP 培養基培養的放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）的抑菌效果顯著。這與文獻所報道的放線菌產生的抑菌活性物質對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌效果相吻合[24]。

2.3 抑菌譜測試結果

采用打孔法對抑菌樣品進行活性測試（孔徑6.00 mm），以大腸桿菌（E.coli DH5α）、金黃色葡萄球菌（S.aureus ATCC 25923）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa ATCC 27853）、假單胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus CICC 21617）、鰻弧菌（V.anguillarum ATCC 19264）、哈維式弧菌（V.harveyi ATCC 33842）、陰溝腸桿菌（E.cloacae ATCC 700323）為測試菌株，以等體積甲醇作為陰性對照。不同受試菌的抑菌結果見圖5。

圖5 抑菌樣品對不同受試菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on different tested bacteria

由圖5 可知，Nocardiopsis sp.HM-01 發酵液粗提物對S.aureus、E.coli、P.aeruginosa、Pseudomonas sp.W407、V.anguillarum 和E.cloacae 有較強的抑制活性，PR 培養基抑菌樣品抑菌圈直徑分別為22.4、17.3、15.0、15.5、16.7、14.2 mm，ISP2 培養基抑菌樣品抑菌圈直徑分別為13.9、14.9、10.5、12.8、10.7、10.9 mm。RP 培養基的抑菌效果顯著高于ISP2 培養基。對V.parahaemolyticus 和V.harveyi 抑菌效果不明顯。

2.4 Nocardiopsis sp.HM-01 次級代謝產物合成基因簇的預測

為進一步探究Nocardiopsis sp.HM-01 發酵液的抑菌機制，本研究對該菌株親緣性較高的N.dassonvillei、N.synnemataformans 和N.dassonvillei sub.alborubida 的17 個基因組序列進行注釋，并采用anti－SMASH 鑒定次級代謝產物基因簇，進一步發掘Nocardiopsis sp.HM-01 潛在的抑菌物質。基因簇信息統計結果見表1。

表1 Nocardiopsis sp.HM-01 潛在的次級代謝產物合成基因簇Table 1 Potential biosynthetic gene cluster related to secondary metabolites of Nocardiopsis sp.HM-01

由表1 可知，3 種放線菌共編碼17 個次級代謝產物合成基因簇，包括3 個NRPS、6 個terpene、3 個siderophore、3 個ectoine、1 個lanthipeptide-class-II、1個T2PKS，其中3 種基因簇與編碼desferrioxamine E、icosalide A/icosalide B、isorenieratene 的基因具有100%的相似性。具有抑菌活性的基因簇有desferrioxamine E、icosalide A、icosalide B、TLN-05220。在這些基因中還包含抗氧化基因簇isorenieratene 以及coelibactin、ectoine、2-methylisoborneol 等。

2.5 抑菌物質的液質聯用（LC-MS）檢測結果

為進一步確定主要抑菌的活性物質，采用超高效液相色譜-質譜聯用儀對Nocardiopsis sp.HM-01 的發酵液進行檢測分析，結果如圖6 所示。

圖6 發酵液中抑菌物質的LC-MS 圖譜Fig.6 LC-MS spectrum of bacteriostatic substances in fermentation broth

由圖6 可知，對應的出峰時間10.4 min、m/z=390的[M-H]-峰為乳桿菌素coelibactin；對應的出峰時間8.8 min、m/z=599 的[M-H]-峰為去鐵胺E（deferoxamine E）；對應的出峰時間9.7 min、m/z=683 的[M-H]-峰為icosalide B。因此，根據質譜推測，該菌株可能會產生coelibactin、deferoxamine E 和icosalide B 這三類物質。據文獻報道，coelibactin 可以作為鋅載體間接調節抗生素的生產[32]。deferoxamine E 是一種鐵螯合劑，能夠通過與宿主體內的鐵相螯合而抑制致病菌增殖。例如，金黃色葡萄球菌是人類細菌感染疾病的主要病原體，在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌株存在的情況下，感染可能發展成致命的、無法治愈的疾病，尤其極易在免疫功能較低的患者中發生。而在鐵限制條件下，deferoxamine E 與各種致病菌對鐵資源競爭從而發揮抗菌活性，抑制細菌的生長[33]。此外，已有文獻報道：68Ga-FOXE 在金黃色葡萄球菌培養物中表征出鐵的快速攝?。?8Ga 為一種短效發生器，能夠檢測到各種鐵載體），這也從一定程度上表明deferoxamine E對金黃色葡萄球菌的抑制活性[34]。icosalide A/B 可通過調節細菌運動和生物膜的形成發揮抑菌作用[30]。據報道，icosalide A/B 對腸球菌和鏈球菌（金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌、糞腸球菌）等細菌具有選擇性抗菌活性[35]。

經antiSMASH 預測的抑菌物質中，還包括TLN-05220（相似度70%），它對一系列革蘭氏陽性病原體具有很強的抗菌活性，包括多種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌菌株，并對多種人類腫瘤細胞系具有細胞毒活性[31]。但LC-MS 并未檢測出TLN-05220，可能是由于TLN-05220 的基因簇表達沉默或低表達，后續還可嘗試其它的培養條件及更靈敏的檢測方法。

3 結論

近年來，海洋放線菌Nocardiopsis 的開發和在農業、食品、環境保護等方面發揮越來越重要的作用。Nocardiopsis 菌屬可以產生豐富的酶類，如幾丁質酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶等，賦予了該類菌株在農業和食品領域的應用潛力。同時，利用環境中的營養物質（污染物）生長繁殖，也可通過產生各種活性化合物調整和改善養殖生態環境、促進水生動物健康生長、實現水產養殖業持續發展。本研究通過對海洋放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 的發酵提取物進行抑菌活性研究，考察其在不同培養條件下對不同種類細菌的抑制程度。結果表明，Nocardiopsis sp.HM-01 的發酵提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的抑制作用，尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、銅綠假單胞菌、假單胞菌的抑菌效果較強，具有一定的廣譜抑菌效果。通過對基因組序列進行次級代謝產物基因簇的注釋，聯合質譜分析，鑒定出兩種具有代表性的潛在抑菌化合物，deferoxamine E 和icosalide B，為該類菌株的深度開發及利用奠定了基礎。