雙水相臨界萃取條件優化方法及其應用

曾穎，曾淑欣，何玉書，林韞琦

（廈門醫學院，福建 廈門 361021）

雙水相萃取技術（aqueous two-phase extraction，ATPS）作為一種新型分離技術，因其操作條件溫和、連續性、易放大等優勢，越來越受研究者的關注，并且已被廣泛應用于生物化學、細胞生物學、生物化工和食品化工等領域[1-3]。雙水相系統是當兩種結構不同的聚合物或兩種鹽，或一種聚合物與一種親液鹽在適當的濃度或在一個特定的溫度下相混合在一起時形成的互不相溶的兩相系統[4]。

目前，在利用雙水相技術或優化雙水相體系的研究中，通常采用單因素控制變量法、正交設計[5]、響應面法[6]、關聯方程式建模[7]等試驗設計方法，探究各因素變量，如分子量、質量分數、系線長度（tie line length，TLL）、溫度、pH 值等對雙水相萃取效果的影響[8-14]。但由于雙水相萃取技術的理論和分配機理相關研究較少，體系的物理、化學性質尚未完全清晰[15]，因此通過以單因素為基礎的試驗設計方法探究最優萃取條件存在一定的局限性[16]。在優化雙水相體系過程中，各變量因素的分子之間容易產生新的相互作用力，特別是加入樣品之后，原始的雙節線會因為樣品的緩沖液環境等因素干擾發生一定程度的偏移，導致成相規律發生變化，其成相臨界點難以確定，因而在臨界點附近的體系構成和優化鮮少被探究，致使優化后的體系往往不夠全面，在實際應用方面會受到一定的限制且造成材料資源的浪費。本文提出一種針對雙水相成相臨界點萃取條件的試驗設計方法，簡稱“52×3 雙水相試驗法”，是專門為優化雙水相臨界萃取體系條件設計的試驗方法。該方法可以從橫向與縱向的二維角度同時將含樣品的雙水相體系的3 個影響因素（上相、下相、樣品）在其成相臨界點附近由點及面直接進行比較優化，并消除兩相及樣品在成相時的相互作用和干擾所產生的體系變量誤差，同時大大降低體系的試劑及原料用量成本，具有快速簡便、經濟適用的特點。

本研究采用該方法設計優化雙水相萃取體系，分別從鮑魚內臟、扇貝內臟、生蠔內臟3 種海洋生物的內臟中分離提取目標酶β-葡萄糖苷酶，分別探究三者的酶活性和萃取效果，以期為未來分離提取和分析海洋生物內臟活性物質的研究提供一個新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內臟（皺紋盤鮑）、扇貝內臟、生蠔內臟-80 ℃下冷凍儲藏待用；對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-GC）活性檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600、1000、1500、2000、4000：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

均質乳化機（A25S）：上海歐河機械設備有限公司；高速冷凍離心機（3-18K）：德國sigma 公司；制冰機（AF100）：意大利斯科茨曼制冰系統有限公司；酶標儀（Epoch 2）：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

本研究以鮑魚內臟為原料，以酶比活為評價參數，探究雙水相萃取目標酶（β-葡萄糖苷酶）的最優雙水相體系條件，以解釋并驗證“52×3 雙水相試驗法”的可行性、簡便性與實用性。

取一定質量的鮑魚內臟，以1∶4 的質量比加入預冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L pH4.5）[17]，在冰浴中用組織搗碎機勻漿后，冰浴浸提1 h 后，用高速冷凍離心機離心（10 000 r/min，4 ℃，15 min），取上清液（粗酶液）待用。

1.3.2 基礎相圖的制作

確定成相的兩物質[5]為PEG600（PEG1000、PEG 1500、PEG2000、PEG4000）和NaH2PO4，分別配制成40%（質量分數）的濃溶液，備用。采用濁點法，在4 ℃環境下制作兩物質的相圖，繪制雙節線。

1.3.3 最優雙水相臨界體系的測定

以PEG600（PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000）/NaH2PO4體系與鮑魚內臟粗酶液為原料，利用“52×3雙水相試驗法”進行優化試驗，分別制作“52”表和“3”點圖，以下相酶比活為指標，探索從鮑魚內臟、扇貝內臟、生蠔內臟中萃取β-葡萄糖苷酶的最優雙水相體系及其對應的酶活力與萃取效果。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶相關參數計算

β-葡萄糖苷酶（β-GC）活性檢測試劑盒：采用p-NPG 比色法，在400 nm 處的吸光值來測定β-葡萄糖苷酶的酶活，酶活定義：每mg 組織蛋白每小時產生1 nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位（U），標準曲線公式為y=0.002 9x+0.001 9，R2=0.999 1；采用Bradford 法，在595 nm 處的吸光值來測定蛋白含量，標準曲線公式為y=0.035 2x+0.559 5，R2=0.991 3；萃取目標酶以下（鹽）相為主，計算公式如下。

式中：A 為酶比活，U/mg；U 為酶活，U/mL；P 為蛋白濃度，mg/mL；n 為純化倍數；A下為下相酶比活，U/mg；A樣為樣品酶比活，U/mg；η 為萃取率，%；U下為下相總酶活，U/mL；V下為下相總體積，mL；U樣為樣品總酶活，U/mL；V樣為樣品總體積，mL。

1.5 52×3 雙水相試驗法說明

1.5.1 “52”成相臨界點的測定

“52×3 雙水相試驗法”中的“52”點，即以相圖的雙節線為基礎，選取中心位置的PEG（縱軸）5 個相鄰的臨界成相點為起點，分別固定每個點的PEG 質量分數，按固定比例增加鹽（橫軸）的質量分數，選取5 個點分別進行試驗。

根據上述雙水相相圖為參考，稱取一定質量的40% PEG600（1000、1500、2000、4000）原液和NaH2PO4加入15 mL 的刻度離心管中，加入一定質量的粗酶液后，加水補至體系總質量為10 g，充分搖勻至無固體沉淀后靜置10 min，4 ℃下3 000 r/min 離心5 min，若體系分相，則記錄上下相體積；若體系未分相，則NaH2PO4加入量增加2%，重新配制體系；成相后，繼續分別增加兩相的質量分數，各配制5 個不同質量分數組成的體系進行酶比活測定。

1.5.2 “3”點對比與驗證

從上述“52”成相臨界點試驗中補充選取每個比活最高點（橫軸）的左右兩點，共3 點進行驗證性試驗，如三點從左到右，第一點或第二點為最優，則可確定該體系中的最優點；若第三點最優，則需按一定間隔繼續增加鹽的質量分數，至穩定的第一點則為最優點。

1.5.3 最優雙水相臨界體系對比與驗證

對上述“52×3 雙水相試驗法”選取出的5 個不同PEG 分子量大小的最優點同時進行試驗比較，即可得成相臨界點最優雙水相體系PEG/鹽的種類與質量組成。以此方法，通過改變體系的組成條件（不同分子量的PEG、不同質量分數組成的PEG 及鹽、不同的粗酶液加入量），可進一步探究不同條件影響下雙水相體系的最優構成條件及規律。

1.6 數據處理

試驗數據通過Excel 進行整理和計算，使用Origin（2021）軟件進行數據可視化分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 PEG/NaH2PO4 雙水相體系總相圖的繪制

分別繪制PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000 在4 ℃環境下的雙水相相圖，合并后如圖1所示。

圖1 PEG/ NaH2PO4 雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of PEG/ NaH2PO4 aqueous two-phase system

相圖的雙節線上方是兩相起始分相區，該區域作為選取不同PEG 種類及PEG 和NaH2PO4質量分數變量的參考基線。

2.2 “52×3”成相臨界最優體系

在圖1 中PEG600 雙節線臨界點附近選取質量分數2%間隔相鄰的“5”個點，以及質量分數間隔2%的NaH2PO4的“5”個點，1 mL 粗酶液，補水至10 g 總體系，進行3 次平行試驗，測定成相體系下相酶比活，結果如表1 所示。

表1 PEG600/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 1 Critical extraction of PEG600/NaH2PO4 aqueous twophase system

由表1 可見，最優體系出現在成相臨界點附近，從表中結果選取最優體系點，進行“3”點驗證，即PEG600 質量分數不變（PEG 質量分數最小變量取2%為最優，再縮小容易不成相或體系不穩定），將NaH2PO4的質量分數取值范圍間隔縮小至最優點（星號點）的加減“1%”，重復3 次試驗，若最高點為由左到右的第一點或第二點，證明該點體系為最優；若最高點出現在第三點，則需以該點為中心點，再次進行左右的“3”點驗證，排除誤差，直至最高點出現在第一點或第二點，最終確定萃取臨界點最優雙水相體系，結果如圖2 所示。

圖2 PEG600/ NaH2PO4 三點驗證圖Fig.2 PEG600/ NaH2PO4 three-point verification diagram

根據上述“52×3 雙水相試驗法”測定PEG1000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優體系，結果如表2 和圖3 所示。

表2 PEG1000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 2 Critical extraction of PEG1000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖3 PEG1000/ NaH2PO4 三點驗證圖Fig.3 PEG1000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據上述“52×3 雙水相試驗法”繼續測定PEG1500/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優體系，結果如表3 和圖4 所示。

表3 PEG1500/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 3 Critical extraction of PEG1500/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖4 PEG1500/NaH2PO4 三點驗證圖Fig.4 PEG1500/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據上述“52×3 雙水相試驗法”繼續測定PEG2000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優體系，結果如表4 和圖5 所示。

表4 PEG2000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 4 Critical extraction of PEG2000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖5 PEG2000/NaH2PO4 三點驗證圖Fig.5 PEG2000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根據上述“52×3 雙水相試驗法”繼續測定PEG4000/NaH2PO4雙水相萃取粗酶液的成相臨界最優體系，結果如表5 和圖6 所示。

表5 PEG4000/NaH2PO4 雙水相成相臨界萃取體系Table 5 Critical extraction of PEG4000/NaH2PO4 aqueous twophase system

圖6 PEG4000/NaH2PO4 三點驗證圖Fig.6 PEG4000/NaH2PO4 three-point verification diagram

采用“52×3 雙水相試驗法”在不同PEG 分子量的雙水相體系中，可以各做出一個“52”體系表和一個“3”點圖。從以上圖表中可以發現，每種PEG 分子量體系對目標酶萃取效果最優的組成比例，均出現在雙水相成相臨界點附近，且由于加入的樣品中含有第3 種成分（乙酸-乙酸鈉），導致雙水相的成相臨界點與原始相圖相比，發生了一定程度的偏移。從“52”體系表可以看出，隨著鹽的質量分數的增加，體系萃取能力總體上表現為逐漸下降或先增后降的趨勢，且隨著PEG 分子質量的增加，最優體系會偏離成相臨界點更多，萃取效果更好；從“3”點圖可以看出隨著PEG 質量分數的增加，體系萃取能力總體上表現為逐漸下降的趨勢。

2.3 最優雙水相臨界體系的對比與應用

分別選取5 個PEG 體系中的最優體系（Ⅰ：12% PEG600/21% NaH2PO4；Ⅱ：10% PEG1000/20% NaH2PO4；Ⅲ：12% PEG1500/17% NaH2PO4；Ⅳ：10% PEG2000/18% NaH2PO4；Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4），以鮑魚內臟、扇貝內臟、生蠔內臟為原料，同時進行下相萃取物總酶活力的比較驗證，結果見圖7。

圖7 各分子量PEG 最優雙水相臨界體系下相萃取目標酶總活力Fig.7 The total activity of PEG with different molecular weight optimal aqueous two-phase critical system on extraction of target enzymes

由圖7 可知，最優雙水相臨界體系為Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4，其下相萃取的總酶活、酶比活、純化倍數、酶活回收率如表6 所示。

表6 最優雙水相臨界萃取體系萃取目標酶的結果Table 6 systemThe results of extracting target enzymes by the optimal aqueous two-phase critical extraction system

由表6 可知，對目標酶的萃取效果上，生蠔內臟＞鮑魚內臟＞扇貝內臟。5 種PEG 分子量分別形成的最優雙水相臨界萃取體系中，PEG4000/NaH2PO4的臨界體系對3 種海洋生物內臟中的β-葡萄糖苷酶萃取效果最好。雙水相體系對β-葡萄糖苷酶的萃取效果與PEG 相分子量大小呈正相關性。當PEG 分子量比較小時，體系萃取效果不佳，目標酶集中在PEG 相，無法萃入鹽相，因此下相收集效果差；隨著PEG 分子量的增加，進入鹽相的目標酶逐漸增加，其原因可能是隨著PEG 分子量增加，疏水性增大，成相時所分配到的水減少，目標酶隨著水相進入鹽相，同時，粗酶液預處理液乙酸-乙酸鈉緩沖液與鹽相均呈酸性，在雙水相體系中會影響體系的pH 值，進而影響蛋白質分子的電離度，成相臨界點偏移，最終會影響被分離物質在雙水相體系中分配活動，促使目標酶富集于鹽相，大量雜蛋白和細胞碎片則停留在PEG 相和雙水相分界層。此外，從圖7 中還可以發現，3 種海洋生物內臟中均含有豐富的β-葡萄糖苷酶，其中，生蠔內臟下相萃取物中總酶活最高，但考慮到鮑魚內臟無法食用，取材豐富且成本極低，以變廢為寶的角度來看更加有研究價值。

3 結論

雙水相萃取技術能溫和高效的從樣本中分離提取β-葡萄糖苷酶，且保留酶的較高活性和純化率。本研究采用的“52×3 雙水相試驗法”不再僅以常規的雙水相相圖為依據，而是直接在試驗中探究加入樣品后的雙水相成相臨界規律，同時以雙因素（PEG/鹽）試驗快速確定雙水相體系臨界點最優的PEG 種類、PEG 質量分數及鹽質量分數，有效解決了各因素之間相互作用而產生的變量誤差，快速且準確的構建針對試驗樣品的最優雙水相萃取體系。同時，本研究通過對3 種海洋生物內臟樣本的雙水相臨界萃取試驗驗證了“52×3 雙水相試驗法”的普遍適用性和應用性，為后續優化海洋生物酶的提取純化方法提供新的試驗思路和研究基礎。