茶堿和可可堿對高脂飲食小鼠體質量和胰島素抵抗的影響

董金婭，何小芳，杜曉翠，方崇業，3*

（1.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省茶深加工工程技術研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

肥胖是一種由代謝紊亂引起的慢性疾病，會增加罹患一些并發癥的風險，如心血管疾病、2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）、高脂血癥、高血壓、心臟病和動脈粥樣硬化等[1-2]。長期食用富含脂肪的食物會導致肥胖，從而引起代謝紊亂和血脂異常，其特征是脂肪堆積、葡萄糖代謝紊亂、胰島素抵抗、低度炎癥和血脂異常[3]，其中血脂異常的特征是總膽固醇（triglyceride，TC）、甘油三酯（total cholesterol，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平降低[4]，這是能量攝入和能量消耗不平衡的結果[5-7]。2016 年約有19 億18 歲及以上的成年人超重，據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）估計，到2025 年，大約有1.67 億人（成人和兒童）將因超重或肥胖而影響身體健康[8]，使引發代謝綜合征的風險增加[9]。目前，常見治療糖尿病的藥物有二甲雙胍、吡格列酮和磺胺類等，但這些降糖藥物普遍存在增加體重、產生耐藥性和導致低血糖等副作用[10-12]，因此需尋找有效、副作用低和耐受性更強的抗肥胖劑[13]。

茶堿和可可堿是天然的甲基黃嘌呤生物堿，二者互為同分異構體[14-15]。前者主要存在于茶葉中，后者主要存在于可可種子、豆類和山茶科植物的葉子中[1，16]。茶堿具有強心、利尿、擴張冠狀動脈、松弛支氣管平滑肌、興奮中樞神經和抗炎等作用，可以用于治療支氣管哮喘、肺氣腫、支氣管炎和心臟性呼吸困難[17-20]。可可堿具有舒張腦血管、利尿、保護牙齒[21]、增加HDL-C[22]和抑制脂肪生成相關基因的表達[23]等作用。研究發現，茶堿有作為治療胰島素抵抗和高血糖癥候選治療劑的潛力[24]，但關于茶堿和可可堿對小鼠體質量和胰島素抵抗影響的研究鮮有報道。因此，本研究使用高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導C57BL/6J 小鼠建立肥胖模型，通過測定茶堿和可可堿對小鼠的體質量、空腹血糖水平和胰島素抵抗等的影響，為茶堿和可可堿能否降脂減肥和緩解胰島素抵抗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶堿（純度≥99%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；可可堿（純度>98%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；雄性C57BL/6J 小鼠[6 周齡，體質量18～25 g，動物許可證號SCXK（川）2020-030]：成都達碩實驗動物有限公司；高脂飼料（D12492，60%熱量來源于脂肪）、低脂飼料（D12450J，含10%脂肪的嚙齒動物飲食）：美國Research Diets 公司。

葡萄糖粉劑：福州海王福藥制藥有限公司；胰島素注射液（H10890001）：江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司。

1.2 儀器與設備

血糖儀（GA3 型）、血糖試紙條：三諾生物傳感股份有限公司；分析天平（FA1004N）：上海精密科學儀器有限公司；解剖鑷-直（F12029-09）、IRIS 眼科鑷-彎（F120007-10）、手術剪-直/尖頭（S14014-11）：昆明迪然科技有限公司；低速離心機（SC-36）：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型及給藥

動物飼養溫度（24±1）℃，相對濕度50%～60%，在無病原體設施中12 h 晝/夜循環，可以自由獲得食物和水。7 d 適應性喂養后，將小鼠隨機分為6 組，3 個低脂飲食（low-fat diet，LFD）組，3 個高脂飲食（high-fat diet，HFD）組。分別為LFD 組（n=8）、LFD+茶堿組（0.5 mg/mL，n=8）、LFD+可可堿組（0.5 mg/mL，n=9）、HFD 組（n=8）、HFD+茶堿組（0.5 mg/mL，n=8）和HFD+可可堿組（0.5 mg/mL，n=9）。將茶堿和可可堿分別加入小鼠飲用水中，配制成0.5 mg/mL 溶液滅菌后給小鼠自由飲用，持續給藥16周。每周定期測量小鼠體質量、空腹血糖（禁食13 h，尾部靜脈采血測定）、飲水量和食物攝入量[25]。所有動物實驗均符合云南農業大學動物實驗倫理審查委員會批準的協議。

1.3.2 腹腔葡萄糖耐量試驗和腹腔胰島素耐受試驗

第14 周進行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT），小鼠禁食13 h，注射葡萄糖溶液前測量并記錄小鼠的空腹血糖和體質量。葡萄糖溶液（原液濃度0.5 g/mL，注射濃度1 g/kg）在30 min內全部注射完成，用血糖儀測量0、30、60、90 min 和120 min 時的血糖值，分別為y0min、y30min、y60min、y90min、y120min，并根據結果繪制折線圖，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）[26-27]，計算公式如下。

A=15×（y0min+2y30min+2y60min+2y90min+y120min）

式中：A 為曲線下面積，min·（mmol/L）。

第15 周進行腹腔胰島素耐受試驗（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），小鼠不禁食，注射胰島素溶液（原液濃度40 U/mL，注射體質量0.75 U/kg），并使用血糖儀測量小鼠在0、30、60、90 min 和120 min 時的血糖值，并根據結果繪制折線圖，計算AUC[28]。

1.3.3 解剖和采血

第16 周實驗結束，收集血液樣本，4 ℃靜置1 h，5 000 r/min 離心收集上清液。迅速解剖小鼠，取小鼠腹股溝脂肪、附睪脂肪和肝臟，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗干凈，再稱質量，按如下公式計算小鼠臟器系數，將組織分裝至離心管轉入-80 ℃保存待用。

I=（G0/G）×100

式中：I 為小鼠臟器系數，%；G0為小鼠各組織質量，g；G 為小鼠體質量，g。

1.3.4 小鼠血清生化指標檢測

小鼠血清送于云南省昆明市第二人民醫院進行檢測，檢測項目為甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。

1.4 數據統計分析

本試驗所有數據均來源于3 個以上重復試驗的平均值，采用GraphPad Prism 9.0 和Adobe Illustrator 軟件進行數據分析和作圖，組間比較采用one-way ANOVA和Tukey's test 分析，p<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 茶堿和可可堿對小鼠體質量、空腹血糖、飲水量和攝食量的影響

為了探究茶堿和可可堿對小鼠體質量和空腹血糖的影響，每周對各組小鼠體質量和空腹血糖進行檢測，結果見圖1、圖2。

圖1 茶堿和可可堿對小鼠體質量的影響Fig.1 Effects of theophylline and theobromine on body mass of mice

圖2 茶堿和可可堿對小鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effects of theophylline and theobromine on fasting blood glucose in mice

C57BL/6J 肥胖小鼠模型建立成功的判斷標準是高脂飲食組平均體質量高于對照組20%[29]。由圖1 可知，HFD 飲食誘導16 周后，HFD 組小鼠平均體質量高于LFD 組21.05%，證明肥胖模型誘導成功。圖1 結果顯示，茶堿給藥1 周后，對小鼠體質量增長出現了明顯抑制作用。在整個實驗周期內，與LFD 組相比，LFD+茶堿組降低小鼠體質量的范圍在4.89%～16.28%；與HFD 組相比，HFD+茶堿組降低小鼠體質量的范圍在7.86%～30.81%，表明茶堿能有效抑制HFD 誘導小鼠的體質量的增加?？煽蓧A對小鼠的體質量無抑制作用，而且從第11 周開始，HFD+可可堿組小鼠體質量超過HFD 組，11～16 周高于HFD 組4.56%～15.59%，表明可可堿可能會導致小鼠體質量增加。由圖2 可知，與LFD 組相比，茶堿和可可堿對小鼠的空腹血糖水平沒有表現出持續穩定的抑制作用；與HFD 組相比，HFD+茶堿組在8～13 周和15～16周的小鼠空腹血糖水平低于HFD 組，而HFD+可可堿組對小鼠空腹血糖的沒有抑制作用。

各組小鼠的食物攝入量和飲水量的結果見圖3、圖4。

圖3 小鼠16 周內平均攝食量Fig.3 Average feed intake of mice during 16 weeks

圖4 小鼠16 周內平均飲水量Fig.4 Average water intake of mice during 16 weeks

由圖3 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組的小鼠攝食量高度顯著增加13.03%（p<0.001）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠攝食量沒有明顯差異，表明茶堿降低小鼠體質量與食物攝入多少無關，反映茶堿不是通過抑制小鼠食欲來減肥。由圖4 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組的小鼠飲水量高度顯著增加49.26%（p<0.001）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組的小鼠飲水量高度顯著增加79.14%（p<0.001），表明食用茶堿可能會引起小鼠饑渴，而可可堿對小鼠攝食量和飲水量均無明顯影響。

2.2 茶堿和可可堿對小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性的影響

肥胖常伴有糖代謝異常，血糖升高的肥胖者中大多存在胰島素抵抗[30-31]。發生胰島素抵抗，葡萄糖耐量必然受損，通常伴隨著高血糖、高血脂和高血壓的發生[32]。因此，研究通過IPGTT 和IPITT 進一步評估茶堿和可可堿對葡萄糖穩態的影響，結果見圖5、圖6。

圖5 茶堿和可可堿對小鼠葡萄糖耐受性的影響Fig.5 Effects of theophylline and theobromine on glucose tolerance in mice

圖6 茶堿和可可堿對小鼠胰島素敏感性的影響Fig.6 Effects of theophylline and theobromine on insulin sensitivity in mice

由圖5A 可知，在測血糖時間為30 min 時，各組小鼠血糖濃度達到峰值，HFD 組和HFD+可可堿組血糖水平較高。在30 min 和60 min 時，LFD+茶堿組血糖水平分別極顯著低于LFD 組26.93%（p<0.01）、26.79%（p<0.01），在90 min 和120 min 時，LFD+茶堿組血糖水平分別顯著低于LFD 組20.65%（p<0.05）、25.54%（p<0.05）。在30～120 min 期間，HFD+茶堿組血糖水平明顯低于HFD 組（20.99%～38.65%）。由圖5B 可知，LFD+茶堿組的葡萄糖耐受AUC 低于LFD 組24.37%；與HFD組相比，HFD+茶堿組的葡萄糖耐受AUC 極顯著降低27.18%（p<0.01）。結果表明，茶堿給藥組的小鼠機體自身能更快產生胰島素降低血糖，從而維持自身血糖水平，說明茶堿可以緩解HFD 誘導小鼠的葡萄糖耐受性。而在30～120 min，HFD+可可堿組的IPGTT 血糖水平比HFD 組高，AUC 也比HFD 組高，表明可可堿可能會使HFD 誘導小鼠糖耐量受損更加嚴重。

由圖6A 可知，在30、60 min 和90 min 時，LFD+茶堿組血糖水平分別高度顯著低于LFD 組37.92%（p<0.001）、51.73%（p<0.001）和52.85%（p<0.001），在120 min 時，LFD+茶堿組血糖水平極顯著低于LFD 組47.36%（p<0.01）。在30 min 和60 min 時，HFD+茶堿組血糖水平分別顯著低于HFD 組29.48%（p<0.05）、45.48%（p<0.05），在90 min 時，HFD+茶堿組血糖水平極顯著低于HFD 組49.77%（p<0.01）。由圖6B 可知，LFD+茶堿組AUC 極顯著低于LFD 組38.02%（p<0.01），HFD+茶堿組極顯著低于HFD 組36.41%（p<0.01）。結果表明，注射胰島素后茶堿給藥的小鼠血糖水平下降更快，對胰島素敏感性的反應更迅速，可以有效緩解HFD 誘導小鼠產生的胰島素抵抗。而HFD+可可堿組血糖水平在30～120 min 期間比HFD 組高，AUC 也比HFD 組高，表明可可堿不僅不能緩解HFD誘導小鼠的胰島素抵抗，反而會使HFD 小鼠胰島素抵抗更加嚴重。

2.3 茶堿和可可堿對小鼠臟器系數的影響

對各組小鼠的器官進行稱重，計算小鼠臟器系數，結果見圖7。

圖7 茶堿和可可堿對小鼠臟器系數的影響Fig.7 Effects of theophylline and theobromine on organ indexes in mice

由圖7 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠的腹股溝脂肪系數降低53.08%，附睪脂肪系數極顯著降低57.20%（p<0.01）。與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠的腹股溝脂肪系數高度顯著降低64.16%（p<0.001），附睪脂肪系數降低27.28%。結果表明，茶堿可以降低小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪堆積，且HFD+茶堿組的腹股溝脂肪系數和附睪脂肪系數低于HFD 組，表明茶堿的降脂作用效果很好。可可堿對小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪無抑制作用，與HFD 組相比，HFD+可可堿組的腹股溝脂肪系數和附睪脂肪系數反而有升高的趨勢。與HFD 組相比，HFD+茶堿組和HFD+可可堿組降低了小鼠肝臟系數，但效果不顯著。

2.4 茶堿和可可堿對小鼠ALT、AST 活力和血脂指標的影響

肥胖常伴隨著血脂異常，會引發心血管疾病。因此檢測了各組小鼠血脂指標和AST、ALT 活力，結果見圖8、圖9。

圖8 茶堿和可可堿對小鼠血脂指標的影響Fig.8 Effects of theophylline and theobromine on blood lipid indicators in mice

圖9 茶堿和可可堿對小鼠ALT 和AST 活力的影響Fig.9 Effects of theophylline and theobromine on ALT and AST activity in mice

由圖8 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠血清的TC 和HDL-C 濃度分別高度顯著降低31.56%（p<0.001）、24.46%（p<0.001），LDL-C 極顯著降低33.33%（p<0.01）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠血清的TG 濃度極顯著降低25.65%（p<0.01），TC 和LDL-C 濃度分別顯著降低30.38%（p<0.05）、43.09%（p<0.05）。結果表明，茶堿能降低HFD 誘導小鼠血清的TG、TC、LDL-C 濃度，但也會降低HDL-C 濃度，因此，關于茶堿對HFD 誘導小鼠的血脂代謝可能有利也有弊。

由圖9 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠血清的ALT 活力顯著降低46.27%（p<0.05），AST 活力降低16.96%；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠血清的ALT 活力高度顯著降低45.77%（p<0.001），但對AST 活力無明顯影響。結果表明，茶堿可以降低HFD 飲食誘導小鼠血清的ALT 活力，但對AST 活力無影響?？煽蓧A對HFD 飲食小鼠血清的ALT、AST 活力和血脂指標均無抑制作用。

3 討論與結論

體質量和脂肪系數是反映小鼠肥胖程度的重要指標[31]，在臨床大數據中顯示肥胖與糖尿病有密切的相關性，血糖升高的肥胖者中大多存在胰島素抵抗。此類病癥想要控制好糖尿病，通過預防糖尿病并發癥的發生和減肥是最有效的方法。本研究結果顯示，與HFD 組相比，茶堿能抑制HFD 誘導小鼠的體質量增加，并且降低了小鼠的腹股溝脂肪系數和附睪脂肪系數，表明茶堿具有減肥降脂的作用。可可堿雖然和茶堿互為同分異構體，但對小鼠體質量和脂肪系數均無抑制作用。

肥胖是全球公共衛生問題之一，通常與代謝性疾病相關，會增加2 型糖尿病患者的發病率和致死率[33-34]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2 型糖尿病的主要特征，主要表現在胰島素作用的靶器官對胰島素敏感性下降，機體為了保持身體的平衡，通過提高胰島素水平來克服其低下的生物學效應[35]。而胰島素抵抗的發生與炎癥密切相關[36]，炎癥因子能干擾胰島素信號通路傳導[37-39]。已有研究證實茶堿具有抗炎的功能[20，40]，并且Gepstein 等[4]的研究表明肥胖是全身胰島素敏感性降低的主要決定因素，體重增加會降低胰島素敏感性，而體重減輕會增加胰島素敏感性。本研究試驗結果發現，茶堿能抑制HFD 誘導的小鼠肥胖，并且，通過IPGTT 和IPITT 結果表明，茶堿能緩解HFD誘導小鼠產生的胰島素抵抗，而可可堿無抑制作用。

肥胖一般伴隨著血脂紊亂，容易發生心血管疾病[7]。研究表明茶堿給藥16 周后可以改善HFD 誘導小鼠的血脂水平，它可以降低TG、TC 和LDL-C 的水平?？煽蓧A對HFD 誘導小鼠的血脂4 項沒有顯著影響，這與以往文獻報道的不一致[41-43]。除此之外，本研究結果顯示，茶堿可以改善HFD 誘導小鼠血清中的ALT 活力，對AST 活力無影響。ALT 和AST 是診斷肝膽系統疾病中應用最廣泛的酶，是判斷肝細胞受損害程度的敏感指標。因此，未來可以通過研究茶堿對HFD 誘導小鼠肝臟的影響，進一步確定茶堿對非酒精性脂肪肝治療方面是否有益。而可可堿會升高HFD 誘導小鼠血清中的ALT 和AST 活力，可能會對小鼠肝臟造成一定的損傷。

研究表明，茶堿能減輕HFD 誘導引起的小鼠體質量增加和胰島素抵抗，但可可堿沒有效果，甚至會增加HFD 誘導的小鼠體質量增加和胰島素抵抗。其次，茶堿能抑制HFD 誘導的小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪堆積，且能抑制HFD 誘導小鼠的TG、TC、LDL-C 和ALT 升高，而可可堿均無抑制作用。對于造成兩者功能差異的原因，有待進一步研究。