強(qiáng)骨抗萎膏通過調(diào)控MFN2及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善失重狀態(tài)下大鼠骨丟失

史長華，田雷瑜，馮 婧，李姝玉，劉軍蓮，劉雨夢，劉嘉鵬，王 謙*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094）

太空飛行中的失重引起的骨質(zhì)疏松，是損害宇航員健康的重要危險(xiǎn)因素。失重導(dǎo)致肌肉、骨骼系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能變化，主要表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松、骨架脫鈣和骨性退化等[1]。中醫(yī)藥在抑制骨質(zhì)流失方面歷史悠久，被廣泛應(yīng)用于航天醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)骨抗萎膏可改善失重狀態(tài)下骨的生物力學(xué)特性，促進(jìn)骨礦鹽的沉積，增強(qiáng)骨密度，減少骨質(zhì)丟失，并能增強(qiáng)骨的代謝功能[2-4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。在應(yīng)激原刺激下，細(xì)胞會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulu mstress，ERS）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊蛋白累積、自噬不足、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥和缺氧時(shí)，ERS被激活[5]。適應(yīng)性ERS可以觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）糾正錯(cuò)誤折疊蛋白并促進(jìn)蛋白清除能力[5-6]，UPR通過三個(gè)主要分支傳遞信號(hào)：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），肌醇依賴性激酶 1（IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子 6（ATF6）途徑。ERS發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）親和力下降，與PERK、IRE1和ATF6分離，然后激活下游信號(hào)分子，如C/EBP同源蛋白（CHOP）[7]。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生能量的主要場所。線粒體融合蛋白MFN2在調(diào)控線粒體運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[6，8]。MFN2出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體結(jié)合部位，越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的特定互動(dòng)和合作是細(xì)胞功能所必需的[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在微重力或力學(xué)負(fù)荷作用下，細(xì)胞功能的變化伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂融合的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)而改變[9]，造成細(xì)胞凋亡，其發(fā)生機(jī)理尚未闡明。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，著重觀察強(qiáng)骨抗萎膏對(duì)模擬失重的尾吊大鼠骨細(xì)胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78，PERK、IRE1α、ATF6和 MFN2 表達(dá)的作用，闡釋強(qiáng)骨抗萎膏對(duì)失重致骨丟失的影響及其可能的分子機(jī)制，為中藥臨床防治失重后骨丟失提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)采用的SPF級(jí)雄性SD大鼠購自中國食品藥品檢定研究院 [許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0005]。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 強(qiáng)骨抗萎膏由航天員科研訓(xùn)練中心提供，由熟地、骨碎補(bǔ)、龜板、懷牛膝等按比例組成（生成批號(hào)：2171101）。阿侖膦酸鈉（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20061303）。骨疏康顆粒（遼寧康辰藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)Z20060270）。BCA蛋白測定試劑盒、蛋白Marker與ECL發(fā)光試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；GRP78和CHOP單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗大鼠PERK、IRE1α、ATF6和MFN2多克隆抗體購自Cell Signaling公司；大鼠單克隆抗體GAPDH和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國proteintech公司；HiFiScript gDNA Removal TM RT Master Mix試劑盒及UltraSYBR Mixture購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.2.2 儀器和設(shè)備 SynergyⅡ型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；熒光定量 PCR 儀（CFX96）、Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)、Bio-Rad濕法電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、模擬失重組、強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組，骨疏康顆粒組；大鼠體質(zhì)量400 g左右，每組12只。模擬失重組：按照Morey-Holton的尾部懸吊28天模擬失重[10]。后肢懸垂與頭部約成30°夾角，大鼠可做旋轉(zhuǎn)活動(dòng)和自由飲食，光照黑暗時(shí)間各12 h。對(duì)照組和模擬失重組為正常飲食和光照，每日灌服生理鹽水。其它3組按上述方法復(fù)制模型，同時(shí)分別每日給予強(qiáng)骨抗萎膏2.4 g/kg；阿侖膦酸鈉0.007 g/kg和骨疏康顆粒0.26 g/kg。

2.2 TUNEL染色檢測凋亡 大鼠脫頸處死后，快速分離出完整的股骨組織，取部分骨于4%多聚甲醛溶液中固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋切片，并進(jìn)行TUNEL染色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。在光學(xué)顯微鏡下（×20）觀察骨細(xì)胞凋亡情況。核棕色為陽性，藍(lán)色為陰性，使用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3 RT-PCR檢測大鼠骨組織中 PERK、CHOP、IRE1α及ATF6 mRNA的表達(dá)水平 分別提取各組大鼠骨組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為RT-PCR的模板。由上海生工設(shè)計(jì)并合成 PERK、CHOP、IRE1α、及ATF6的引物序列（表1），以GAPDH 作為內(nèi)參照，通過2－ΔΔCt法比較各組大鼠骨組織mRNA的相對(duì)含量。

2.4 Western blot檢測大鼠骨組織中GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP及MFN2蛋白的表達(dá)水平 提取骨組織蛋白進(jìn)行濃度測定。Western blot檢測各組大鼠骨組織中 GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP 及MFN2的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，利用目的蛋白與內(nèi)參的光密度比值作為相對(duì)表達(dá)量，對(duì)各組數(shù)值進(jìn)行比較分析。

2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)若無說明均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果中多組比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 骨細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL染色結(jié)果表明，對(duì)照組有個(gè)別細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比，模擬失重組大鼠骨凋亡細(xì)胞數(shù)量增多（P<0.05）；與模擬失重組相比，強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05）），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況

3.2 Western blot檢測各組大鼠骨組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78蛋白的表達(dá) Western blot的結(jié)果顯示，GRP78蛋白表達(dá)量模擬失重組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠骨組織GRP78蛋白表達(dá)

3.3 各組大鼠骨組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路分子PERK、CHOP、IRE1α 和 ATF6 mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示模擬失重組PERK mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.01），強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組明顯降低（P<0.01）。CHOP、IRE1α和ATF6 mRNA表達(dá)量水平在各組間無明顯差異，見圖3。

圖3 各組大鼠骨組織PERK、CHOP、IRE1 α和ATF6 mRNA的表達(dá)

3.4 Western blot檢測各組大鼠骨組織PERK及CHOP蛋白的表達(dá) Western blot的結(jié)果顯示，PERK和CHOP蛋白表達(dá)量模擬失重組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠骨組織PERK及CHOP蛋白表達(dá)

3.5 Western blot檢測各組大鼠骨組織IRE1α和ATF6蛋白的表達(dá) Western blot的結(jié)果顯示，IRE1α蛋白表達(dá)量各組間無明顯差異。ATF6蛋白表達(dá)量模型組明顯高于對(duì)照組（P<0.01），強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.01），見圖5。

圖5 各組大鼠骨組織IER1α和ATF6蛋白表達(dá)

3.6 Western blot檢測各組大鼠骨組織MFN2蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，MFN2蛋白表達(dá)量模擬失重組明顯低于對(duì)照組（P<0.01），強(qiáng)骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著增高（P<0.01），見圖6。

圖6 各組大鼠骨組織MFN2蛋白的表達(dá)

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨”，骨骼改變與腎密切相關(guān)[11]。故較多研究者從腎論治，開展中醫(yī)藥改善失重大鼠承重骨丟失的相關(guān)研究[12]。本課題組近年選用強(qiáng)骨抗萎膏治療骨質(zhì)疏松取得較好療效[2-4]。強(qiáng)骨抗萎膏主要由熟地、骨碎補(bǔ)、龜板、懷牛膝等組成。骨碎補(bǔ)藥用部分為水龍骨科附生槲蕨的干燥根莖，主要活性成分為黃酮類化合物。研究表明，骨碎補(bǔ)或其提取物能促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖和分化，并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子活性[13-14]。骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)IL-1β介導(dǎo)的軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)骨抗萎膏組較模擬失重組降低了成骨細(xì)胞凋亡，說明強(qiáng)骨抗萎膏在一定程度上可以緩解失重狀態(tài)下骨丟失的進(jìn)程。

GRP78是ERS中一個(gè)重要的分子伴侶，被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性蛋白之一。在長時(shí)間或過強(qiáng)的ERS反應(yīng)時(shí)，UPR的所有3個(gè)分支PERK、IRE1以及ATF6與GRP78分離后，均可誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。CHOP是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異轉(zhuǎn)錄分子[16]。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模擬失重大鼠骨組織GRP78、PERK和ATF6表達(dá)量顯著增高，說明失重使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨組織發(fā)生了ERS。模擬失重組與對(duì)照組相比CHOP表達(dá)水平升高，表明CHOP途徑可能是失重環(huán)境引起大鼠骨組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一；與模擬失重組比較，強(qiáng)骨抗萎膏、阿侖膦酸鈉和骨疏康顆粒組，GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)降低，說明強(qiáng)骨抗萎膏能減輕 ERS程度與抑制GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)骨抗萎膏降低了ATF6和CHOP的蛋白水平，而不影響其mRNA的表達(dá)，推測強(qiáng)骨抗萎膏可能通過增加ATF6和CHOP的降解而不是降低其產(chǎn)生來調(diào)節(jié)ATF6和CHOP。

MFN2是一種含有757個(gè)氨基酸高度保守的線粒體蛋白，具有GTPase活性。MFN2位于線粒體外膜上，在線粒體融合中起關(guān)鍵作用。早在2008年，研究發(fā)現(xiàn)，MFN2富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的接觸點(diǎn)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的形態(tài)[17]。在MFN2敲低的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的距離增加，導(dǎo)致線粒體Ca2+攝取受損，干擾線粒體Ca2+平衡[18-19]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MFN2表達(dá)降低后增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的距離，使細(xì)胞對(duì)鈣離子凋亡信號(hào)更敏感[20]。另有研究表明，MFN2高表達(dá)通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子大量涌入線粒體，造成線粒體鈣超載引發(fā)凋亡[21]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究證實(shí)，失重狀態(tài)可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，MFN2表達(dá)降低，強(qiáng)骨抗萎膏可增加MFN2的表達(dá)，提高M(jìn)FN2能保護(hù)骨組織免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，在一定程度上保護(hù)失重狀態(tài)下骨組織的丟失。提示強(qiáng)骨抗萎膏可通過上調(diào)MFN2的表達(dá)緩解失重帶來的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷。

綜上所述，強(qiáng)骨抗萎膏能明顯降低骨組織細(xì)胞凋亡水平，減緩ERS進(jìn)程，其機(jī)制可能與調(diào)控MFN2的表達(dá)、抑制ERS的激活有關(guān)，但具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。