玉米新品種中研1603 制種技術(shù)及純度鑒定引物篩選

王小博 常 曉 楊兆生 李 健

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽 455000）

玉米大田種植中，雜交種的整齊度是玉米高產(chǎn)的關(guān)鍵條件，除去人為管理、天氣變化因素，雜交種純度、籽粒飽滿度、籽粒均勻度和發(fā)芽率均會在一定程度上影響雜交種的整齊度。現(xiàn)在的種子生產(chǎn)中，由于田間管理不力、地力均勻度差、母本去雄程度不夠等因素均對雜交種的籽粒均勻度產(chǎn)生影響。因此結(jié)合中研1603（M109×M173）自身的一些特點針對性地制定了制種技術(shù)，按照此方法操作制出的中研1603 雜交種在種子純度、籽粒飽滿度、均勻度和發(fā)芽率上均會有所提高。

1 制種地塊的選擇

玉米雜交種制種基地所需的土地應(yīng)為肥沃、便于隔離、交通方便、排水灌溉方便、無疫病蟲害、最好能夠連片種植的地塊。

2 隔離方式

通常情況下采用時間隔離和空間隔離等措施。時間隔離 錯開授粉時間以完成制種任務(wù)。由于播種季節(jié)的不同，所需的間隔天數(shù)有些許差別。采用春播制種，氣溫偏低，玉米生長較慢，應(yīng)適當(dāng)增加間隔天數(shù)，一般情況下與異品種間隔離時間不少于40d；在夏播制種，氣溫較高，玉米生長快，可適當(dāng)減少間隔時間，一般夏播時，品種間隔不少于30d。時間隔離上面臨成熟度的問題，由于間隔時間過長，影響后播品種成熟度，從而影響后播玉米品種制種質(zhì)量。

空間隔離 現(xiàn)代玉米制種上多采用空間隔離法。異品種間在垂直隔離距離不少于200m；如果制種田處于異品種的低海拔位置或者下風(fēng)口應(yīng)把垂直距離增加到300m；如與異品種處在同一海拔、無遮擋條件下，水平隔離距離應(yīng)不少于400m；如果采用高稈作物隔離帶隔離，其高稈作物隔離帶寬度不應(yīng)低于30m；若與異品種地塊上存在水平空間間隔，兩者每增加100m 的距離，可以減少10m 的高稈作物隔離帶；如果與異品種間存在村莊、樹林、山丘等地理隔離條件，其自然隔離屏障在50m 以上為宜，自然屏障每減少10m，應(yīng)相應(yīng)增加80m 間隔距離或者增加8m 的高稈作物隔離帶[1]。

3 親本的繁育及中研1603 純度檢測引物的篩選

3.1 制種親本原原種的需求量在制種過程中親本的純度對后代雜交種的純度起著決定性的作用，結(jié)合計劃生產(chǎn)應(yīng)用中對該品種的需求量，一次性制備好所需要的親本原原種，減少由于多次繁種造成的種子純度降低、材料退化等不良問題。中研1603制種所需種子量見表1（可根據(jù)種子的發(fā)芽率等進(jìn)行增加或者降低處理）。

表1 中研1603 雜交種用種量

3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳對中研1603雜交種純度的檢測

3.2.1 篩選適合用于測定的DNA引物 利用玉米常用于品種一致性檢測的40 對引物，對中研1603 的父母本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。由圖1 可得第4、5、9、11、13、14、21、22、27、28、30 對 引 物 在 其親本上表現(xiàn)出片段大小的差異，可用于檢測中研1603 制種中是否發(fā)生自交。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，選定第4、9 對引物可以作為鑒定雜交種制種純度的引物。

圖1 中研1603 父母本聚丙烯酰胺凝膠電泳表現(xiàn)

3.2.2 利用篩選到的引物對中研1603進(jìn)行純度檢測 利用第4、9 對引物（引物序列見表2）對中研1603 雜交種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。由圖2 可以看出，利用第4、9對引物對10 個中研1603 雜交種樣品進(jìn)行檢測，可以看到其雜交種帶型與其雙親帶型表現(xiàn)一致，說明這10 份中研1603 雜交種樣品均為雜交種材料，其中未混有親本自交系。

圖2 10 份中研1603 雜交種聚丙烯酰胺凝膠電泳表現(xiàn)

表2 第4、9 對引物序列

4 雜交種的制備

4.1 種子的處理繁育的親本出庫后，需要懸掛于架子上進(jìn)行晾曬（不可置于水泥地和柏油路面上），對種子進(jìn)行干燥處理，并將其內(nèi)部的小粒、爛粒、霉粒和癟粒等不良籽粒檢出，用包衣劑拌種[2]，測其發(fā)芽率（發(fā)芽率在95%以上可進(jìn)行單粒播種[3]）。

4.2 種植密度和行比雜交種中研1603 的母本屬于株型緊湊、葉寬、大穗型，種植密度不易過大，以5000 株/667m2為宜；其父本株型緊湊、葉片窄，雄穗長且分枝少，分枝數(shù)3～5 個。因此父母本行比在1∶4 最為適宜，且父本較母本晚播6d 最為適宜。

4.3 播種方式播種方式?jīng)]有過多要求，掌握好株距即可，播種深度以5cm 為宜，經(jīng)過挑選和包衣后的種子發(fā)芽率在95%以上可以采用單粒播種，減少播種量；若發(fā)芽率較低應(yīng)加大播種量，以保證畝苗數(shù)。播種期間最好施用種肥，以保障種子在苗期不缺肥。播種后應(yīng)及時澆水，做到一播全苗。

4.4去雜調(diào)整花期去雜出苗后及時調(diào)查出苗情況，在苗期3～5 片葉后及時間苗、定苗。間苗定苗期間母本應(yīng)撥除弱小苗、特大苗和病害苗，父本行去除畸形苗，保留正常苗。抽雄前是玉米去雜的關(guān)鍵時期，此時玉米的標(biāo)準(zhǔn)性狀均已表現(xiàn)出來，去雜時需要將父母本行的懷疑株、母本行弱小株全部拔除并帶出制種田。父母本標(biāo)準(zhǔn)株見圖3。

圖3 中研1603 親本開花期和穗的標(biāo)準(zhǔn)圖

調(diào)整花期 由于天氣和管理的影響，親本的花期會有一定的誤差。在抽雄前關(guān)注父本葉片數(shù)、預(yù)測父本的散粉時間及時調(diào)整母本的去雄時間，防止出現(xiàn)父母本花期不遇的現(xiàn)象。如果授粉期間遇到不良天氣，應(yīng)及時進(jìn)行人工輔助授粉，輔助授粉最好選在9：00-11：00 期間，如果授粉期間的溫度不高于32℃可以全天授粉[4]。授粉結(jié)束后去除全部田間父本行，減少田間肥料的浪費，防止出現(xiàn)錯收的現(xiàn)象。

及時收獲和入庫 在籽粒黑粉層出現(xiàn)后收獲能夠保證種子充分灌漿，減少秕粒的比例，增加產(chǎn)量。收獲后的玉米果穗要及時晾曬（不可置于水泥地和柏油地面），晾曬完成后進(jìn)行選穗、去雜工作，去除懷疑穗、霉?fàn)€穗，同時做到同一材料統(tǒng)一放置，以免混雜。最后進(jìn)行脫粒、篩選、殺蟲、分裝、入庫（籽粒含水量在14%以下）。

5 制種期間田間管理要點

5.1 水肥管理苗期由于土壤、肥水、種子等問題，會出現(xiàn)幼苗長勢不齊等現(xiàn)象，應(yīng)及時為長勢弱的幼苗追施尿素促其生長；拔節(jié)期是玉米需肥的關(guān)鍵時期，此時玉米雌、雄穗開始分化，玉米生長加快，每667m2應(yīng)著重追施尿素10kg、磷酸二氫鉀5kg，施肥后及時補水，需注意根據(jù)幼苗長勢酌情增加或減少用肥量；玉米大喇叭口期是玉米營養(yǎng)生長和生殖生長同時進(jìn)行時期，對肥水的需求量最大，需重施穗肥尿素15kg[5]。對缺苗嚴(yán)重的地塊作報廢處理。制種田最好不進(jìn)行補苗處理，以免出現(xiàn)補錯苗的情況。

5.2 病蟲害管理玉米病蟲害防治應(yīng)以防為主，以治為輔。玉米制種田在整個生長期間要求田間無雜草，注意防止苗期草荒，在玉米苗3～5 葉期噴施除草劑。苗期注意防治地老虎、蚜蟲、薊馬、灰飛虱為害；7 月中旬及時防治玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲等蟲害[6]；授粉結(jié)束后噴灑殺蟲劑與殺菌劑防治穗期病蟲害。