水平基因轉移促進細菌耐藥性傳播機制的研究進展*

李嘉敏 綜述,張 玲 審校

廈門大學附屬成功醫院,福建廈門 361003

在抗菌藥物給臨床治療帶來極大便利的同時,抗菌藥物的濫用使得細菌耐藥性問題逐年加重,新藥研發的速度遠跟不上細菌耐藥出現和擴散的速度。多種耐藥性基因在全球快速蔓延,多重耐藥細菌出現頻率增加,臨床可選擇的抗菌藥物越來越少,多黏菌素和廣譜抗菌藥物碳青霉烯類抗菌藥物等在很多時候成了最后一道防線。然而,因為可以使動物更快地長肉,多黏菌素被用作動物飼料的添加劑在畜牧業上頻繁使用,這加速了環境中多黏菌素耐藥細菌的出現。事實上早在2015年我國的科學家便在食用動物和人體內發現并分離出了可使細菌對多黏菌素產生耐藥性的新型耐藥基因即mcr-1,這種基因可以通過各種途徑在細菌與細菌間轉移,使多黏菌素的耐藥性擴散[1]。美國的研究人員也發現了對多黏菌素耐藥的病原菌[2]。而對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的基因NDM-1則更早被發現,國內耐碳青霉烯類抗菌藥物病原菌的分離率也居高不下[3]。這些耐藥基因的出現和快速擴散,加劇了人們對超級細菌感染的恐懼。為了尋找遏制耐藥基因擴散的有效措施,了解耐藥基因在細菌中是如何傳遞的就顯得十分重要。本文描述了細菌抗菌藥物抗性基因(ARGs)形成的機制,并重點闡述了水平基因轉移機制(HGT)對細菌耐藥基因傳播的作用。

1 細菌耐藥基因的形成與轉移

細菌細胞結構簡單,調節機制不完善,在環境的影響下基因更容易發生突變,盡管突變的方向隨機性較大,但在抗菌藥物的壓力下突變后獲得ARGs的細菌被篩選出來,再通過HGT使得細菌耐藥的比例逐漸上升。有研究揭示了細菌抗藥性形成的關鍵機制,當接觸多次、高致死量抗菌藥物,細菌會以“休眠”的方式暫時性躲避抗菌藥物的攻擊,從而形成耐藥性,更重要的是,暫時性休眠階段,細菌會快速累積抵抗抗菌藥物的基因突變,最終形成耐藥性[4]。有研究發現,病原菌會將自身的DNA序列通過注射系統導入附近的放線菌中,再與放線菌中的抗性基因發生整合,待放線菌裂解死亡后一起釋放到環境中,被另一個病原菌識別并吸收從而獲得耐藥性,研究者們將這一過程稱為“帶回模型”[5]。甚至在特定的環境下,即便抗菌藥物不存在時,細菌也會產生抗菌藥物耐藥性,例如研究人員發現當將細菌放置在壓力環境中時,例如在高溫下培養它們時,這些細菌能夠自發地對抗菌藥物利福平產生耐藥性[6]。

雖然細菌ARGs的產生有著多種機制,但耐藥基因在細菌間的傳遞才是細菌耐藥性擴散的主要原因?；虻拇怪眰鬟f使得親本的耐藥基因得以在子代細菌延續,而細菌耐藥基因的水平轉移卻使得耐藥基因在不同的菌株、菌種間甚至屬間迅速蔓延,造成更大的危害。事實證明,細菌耐藥基因水平轉移的效率也超乎想象。利用先進的顯微成像技術,有研究團隊成功地看到了細菌之間耐藥性的快速轉移,他們將一種對四環素敏感的大腸桿菌與另一種對四環素耐藥的大腸桿菌混在一起培養,結果僅過了3 h就有70%的敏感菌株也變得耐藥[7]。鑒于在非致死劑量的抗菌藥物環境中耐藥細菌的比例逐漸升高,科學家們認為抗菌藥物可以加速細菌之間基因交換的頻率,但也有一些人認為抗菌藥物可能殺死了原來的發生基因交換的“親本”菌株,而在選擇過程中新產生的耐藥菌株繁殖起來,LOPATKIN等[8]的研究卻在單細胞水平上證實ARGs交換并不受抗菌藥物影響。上述研究結果表明細菌耐藥基因的水平轉移機制需要進行深入的研究和探討。

2 HGT機制對抗菌藥物耐藥基因傳播的作用

2.1接合 接合是細菌利用性菌毛互相連接形成通路,將遺傳物質(主要是質粒DNA)從供體菌轉移給受體菌的過程,是一種通過細菌間直接接觸來傳遞大段DNA的遺傳重組現象。接合是一個復雜的過程,由多個步驟組成,但最關鍵的步驟在于細菌要通過膜表面的性菌毛互相接觸然后形成一個相對封閉的“DNA轉移通路”。這條轉移通路的形成需要F-質粒的參與,F-質粒基因組上有1/3的基因都是接合轉移所必需的基因,可以說有F-質粒的細菌才能成為接合的供體細菌,微生物學上形象地將這種細菌稱為雄性菌[9]。越來越多的研究表明,盡管都是細菌基因交流的有效途徑,但相比于噬菌體介導的轉導和環境DNA的轉化,細菌質粒參與的接合是最具影響力的HGT機制[10]。這是因為性菌毛形成的“DNA轉移通路”提供給基因一個相對外界較為封閉且安全的轉移環境,相對于轉化而言受周圍環境影響較小,轉移效率更高,通常比噬菌體轉導有一個更廣泛的宿主范圍。顯然,若能找到合適的措施阻滯性菌毛形成“DNA轉移通路”這個過程的發生,便可以有效地抑制細菌間通過接合進行基因交流。還有研究發現,接合質?？梢宰R別大約90%以往被認為不可通過接合轉移的質粒中的oriT序列(一種高度保守的起始序列)或者其他DNA序列[11],帶動這些非接合質粒進行轉移,研究者們稱之為“質粒動員”[12],這種機制的存在使得接合所能轉移的基因更加多樣。因此,如何促進接合質粒的丟失或者抑制“質粒動員”的發生,為有效降低接合轉移的效率提供了新的思路。

人類真菌病原體卷枝毛霉通過兩種不同的機制對抗真菌藥物FK506(他克莫司)產生自發耐藥性。一種是孟德爾突變,這種突變會產生穩定的耐藥性;另一種通過表觀遺傳RNA干擾(RNAi)介導的途徑發生,導致不穩定的耐藥性。當在不暴露于藥物的情況下生長時,FK506耐藥性表位突變體容易回復為藥物敏感性野生型表型。盡管只在兩種卷枝毛霉菌物種中證實了這種“表突變”,但研究人員認為這些“表突變”有可能在各種情況下被利用,使得生物體能夠適應不利的環境,當環境改善時再轉變回來[13]。在缺乏抗菌藥物壓力選擇的情況下,如果耐藥基因的成本很高,預計耐藥細菌將恢復對藥物敏感的狀態,然而,許多耐藥基因在細菌缺乏抗菌藥物的情況下會長期存在。HGT(主要是接合)可以解釋這種持久性,但有人認為需要非常高的接合率,LOPATKIN等[8]證明了即使是昂貴的普通接合質粒,在大腸桿菌中也能以足夠高的速率轉移,在沒有抗菌藥物的情況下仍能維持。接合機制的存在是細菌保持耐藥性的重要原因,在細菌耐藥性已經產生的情況下,僅減少抗菌藥物的使用可能不足以逆轉耐藥性。因此,結合抑制接合和促進質粒丟失將是限制接合輔助的抗菌藥物耐藥性持續存在的有效策略[14]。

2.2轉導 轉導是噬菌體侵入細菌后通過基因重組將細菌基因組的部分基因整合到自身基因組中,在源細菌裂解死亡之后再導入其他細菌中的過程。轉導機制的存在不僅可以為受體細菌輸送抗性基因等有益基因,也為噬菌體自身的生存和繁殖提供了便利[15]。研究者們在不同種類的細菌中都發現了以噬菌體為中介轉移ARGs的現象:化膿性鏈球菌菌株之間紅霉素、四環素耐藥或多重耐藥的傳導;腸球菌之間四環素和慶大霉素耐藥的轉移;大腸埃希菌和沙門氏菌間β-內酰胺酶基因的交流;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中抗菌藥物耐藥性質粒的轉移[16]。相比于接合轉移需要細菌之間通過性菌毛接觸,轉導過程中噬菌體的參與使得HGT不受時間和空間的限制,具有更大范圍以及更多的參與物種。曾有研究表明,噬菌體介導的轉導作用并不局限于在親緣關系較近的細菌物種間轉移基因,在很多遠緣的細菌間也可以發生,甚至高度保守的基因序列如16S rRNA等中也發現過噬菌體的基因[17]。通過CRISPR間隔區和轉運RNA(tRNA)匹配等方法,有學者找出了病毒相對應的微生物宿主,發現有些噬菌體甚至可感染不同門水平的細菌[18]。該研究表明雖然理論上噬菌體對細菌的感染有較強的專一性,但有些寬宿主噬菌體的存在使得ARGs通過轉導可以在不同種屬甚至不同門水平細菌之間發生轉移。宏基因組學分析的結果也表明,河水[19],土壤[20],污水[21],畜禽糞便[22]等環境噬菌體基因組中都存在多種ARGs[23]。這些結果提示,不應低估噬菌體介導的轉導作用在自然環境中對ARGs水平轉移的貢獻。然而,徹底消滅環境中的噬菌體并不現實,事實上研究人員反而對利用噬菌體來進行實驗和生產進行了很多嘗試并獲得了一定的成果。但是若能利用噬菌體感染細菌的特性,在其中導入與抑制HGT相關的基因如抑制接合的基因并投入到環境中,那么寬宿主噬菌體反而可以變成一個絕佳的選擇。

轉導是通過噬菌體介導的細胞間基因水平轉移的機制,根據不同的轉導方式可分為普遍性轉導和局限性轉導。普遍性轉導是以噬菌體為載體,將供體菌的一段DNA通過同源重組整合到受體基因組中,轉導顆粒的遺傳物質主要是供體菌DNA,理論上轉移的DNA可以是供體菌染色體上的任何部分,該過程可由溫和或烈性噬菌體在裂解期介導完成。普遍性轉導在ARGs的轉移和細菌獲得新基因的過程中發揮了重要作用,并幫助基因在細菌群落間傳播[24]。普遍性轉導對噬菌體與宿主細菌均有利,通過整合溫和噬菌體使細菌攜帶ARGs,促進細菌存活及噬菌體的增殖[25]。噬菌體與宿主的相互作用,有利于兩者在快速變化的環境中更好地生存。雖然兩種轉導方式均由噬菌體介導,但相比于理論上可轉導供體菌任何基因的普遍性轉導,局限性轉導只能由溫和噬菌體在溶原性后期介導完成且僅能傳遞供體菌染色體上原噬菌體整合位置附近的基因,這表明以這種方式轉移的基因數量是有限的[26]。因此,與普遍性轉導相比,局限性轉導對基因轉移的貢獻較小。此外,金黃色葡萄球菌溫和噬菌體參與了一種他們稱為橫向轉導的獨特形式的轉導。橫向轉導是一種新的且相較于普遍性轉導似乎更高效的轉導方式,葡萄球菌前噬菌體不遵循原先的“切除-復制-包裝”途徑,而是在其裂解程序的后期切除。在這里,DNA包裝從整合的前噬菌體原位開始,包括金黃色葡萄球菌基因組數十萬堿基的大同位異構體以非常高的頻率包裝在噬菌體頭中。DNA包裝之前的原位復制會產生多個前噬菌體基因組,以便在正常噬菌體成熟期間形成橫向轉導顆粒,將金黃色葡萄球菌染色體的部分轉化為基因轉移的超移動區域[27]。橫向轉導機制的發現說明噬菌體轉導在細菌基因交流方面還可能存在許多獨特的機制,對這些獨特機制的研究或許可以為抑制ARGs的傳播提供新的思路。

2.3轉化 轉化是指受體細菌在特殊狀態下可直接吸收外界環境中游離的DNA片段并將其整合到自身基因組中,從而獲得相對應遺傳性狀的現象。相比于接合與轉導,轉化所需的條件顯得更加苛刻,只有在細菌處于感受態且環境中存在可吸收的游離DNA時才能進行,而且吸收的DNA必須整合在細菌自身的基因組中才能表達[28]。細菌的自然轉化涉及DNA的吸收和基因組整合,目前已在至少八十多個物種中得到證實。細菌的進化分析結果表明,自然轉化現象廣泛存在于細菌界[29],因此可能有更多的細菌具有發生自然轉化的潛力[30]。轉化機制的存在為細菌在不同物種之間進行基因的水平轉移提供了新的途徑。有研究表明細菌可以通過轉化獲取抗性基因以最大限度地提高對隨機壓力環境中的適應度[31]。顯然,細菌可以利用轉化機制吸收環境中的ARGs,從而引起細菌多重耐藥的產生。轉化機制的存在給ARGs的轉移提供了新的選擇,也增大了親緣關系較遠的細菌之間發生基因轉移的可能性。

科學家們認為轉化的關鍵在于細菌感受態的形成,他們發現只有奈瑟氏菌[32]、鮑曼不動桿菌[33]和鴨疫里默氏桿菌[29]等少數菌不需要特殊誘導就天然具有自然轉化的能力,而大部分可發生自然轉化的細菌,如枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌和嗜肺軍團菌等只有在特定的環境條件或處于某種特定的生理狀態下才具有自然轉化的能力[34]。與細菌感受態形成相關的因素有很多,如壓力刺激、營養信號或群體感應等。抗菌藥物可以誘導肺炎鏈球菌[35]、嗜肺軍團菌[36]自然感受態的形成;營養缺乏環境會誘導流感嗜血桿菌自然感受態的發生[37];豐富的幾丁質能夠誘導副溶血性弧菌、創傷弧菌、霍亂弧菌等弧菌屬細菌自然感受態形成[38];霍亂弧菌、枯草芽孢桿菌的自然感受態與細胞密度有關[39]。盡管誘導感受態形成的條件在細菌物種之間差異很大,但參與DNA攝取的蛋白質卻是高度保守的,SUN[40]描述了細菌中保守的DNA攝取系統,也介紹了一些非經典的自然轉化機制,如在枯草芽孢桿菌中發現了高效的供體細胞依賴性細胞間自然轉化,盡管這需要細胞之間緊密接近[41]。感受態形成的條件千差萬別,想通過改變環境條件同時抑制不同種類細菌感受態的形成似乎比較困難,但細菌高度保守的DNA攝取系統為抑制感受態細菌利用轉化機制吸收環境中的ARGs提供了可能,這值得深入地研究。

3 小 結

隨著抗菌藥物在醫療和農業等領域的廣泛使用,細菌耐藥性問題也愈發嚴重,出現了許多泛耐藥的超級細菌,抗菌藥物的研發已經跟不上細菌耐藥性傳播的速度,為臨床感染疾病的治療帶來了很大的挑戰。盡管科學家們早就意識到了這一點并積極呼吁合理使用抗菌藥物,國家也出臺了相關法規,從每年的細菌耐藥監測結果來看起到了一定的作用,但現狀仍不容樂觀[42]。在細菌耐藥性已經產生的情況下,因為HGT的存在,僅減少抗菌藥物的使用并不足以逆轉耐藥性。因此,除了合理使用抗菌藥物外,充分了解HGT的作用機制將為監測和控制細菌多藥耐藥提供新的思路。細菌質粒參與的接合是最具影響力的HGT機制,而轉導和轉化機制的存在,使得HGT具有更大范圍以及更多的參與物種?？茖W家們同時也在積極探索發生HGT的其他分子機制,如基因轉移因子(GTA)介導的HGT頻率是其它機制的數百萬倍,是在海洋環境中發生HGT轉移的重要機制[43],雖然還沒有研究證明GTA與ARGs的轉移密切相關,但值得密切關注。為了抑制HGT,許多研究者們將目光聚焦在尋找或者開發能夠阻礙細菌質粒接合的抑制劑如天然接合抑制劑坦澤酸等[44]。然而,“質粒動員”機制的存在使得接合所能轉移的基因更加多樣,因此如何促進接合質粒的丟失或抑制“質粒動員”也是一個值得研究的方向。噬菌體介導的轉導機制在ARGs的轉移過程中發揮了重要作用,而橫向轉導機制的發現說明仍然低估了轉導的基因轉移效率。雖然無法完全消滅環境中的噬菌體,但可以利用噬菌體傳播特定的基因來間接達到抑制ARGs轉移的目的,寬宿主噬菌體的存在為這一設想提供了便利。轉化在細菌適應環境、新物種形成以及進化等方面具有重要的作用,對耐藥基因的傳播作用也是不容忽視的。雖然細菌誘導感受態形成的條件千差萬別,但保守的DNA攝取系統為抑制細菌轉化提供了可能。綜上所述,對HGT機制的深入研究對控制細菌耐藥性傳播至關重要。