復方葶藶子湯降低COPD-PAH大鼠肺動脈壓的機制研究

劉 俊 管 聘 朱俊米 柏正平

湖南省中醫藥研究院附屬醫院呼吸科，湖南 長沙 410006

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是以肺中血管重構，肺血管收縮反應性增強導致平滑肌增厚，進而引起管腔狹窄及機化導致肺動脈壓持續性升高的病理過程。PAH發病機制非常復雜，肺血管的功能結構受到多種細胞因子、離子通路、信號通路的影響[1-2]。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)阻塞氣流使機體長期處于低氧狀態，這種低氧狀態可刺激多種信號分子及相關通路對肺血管產生影響，改變肺血管的結構和功能，發展成慢性阻塞性肺疾病相關性肺動脈高壓(COPD relatedpulmonaryarterial hypertension，COPD-PAH)。深入研究COPD-PAH發病機制及有效的治療手段，有益于指導臨床上防治肺心病。氧化應激近年來已成為PAH發病機制中研究最熱的學說之一[3-4]。研究[5]顯示，氧化應激可通過多種途徑參與肺動脈血管重構加速PAH的進展。有實驗[6-7]表明抗氧化治療，可抑制肺動脈血管重塑及減輕肺循環壓力，這表明氧化應激是肺動脈高壓形成的重要因素。本課題柏正平教授根據多年臨床經驗及COPD-PAH中醫病機原理，根據“飲瘀同治”的治則創立了復方葶藶子湯。研究顯示復方葶藶子湯可明顯改善COPD-PAH患者臨床癥狀及減少急性發病次數，動物實驗[8-10]證實復方葶藶子湯可降低肺動脈高壓，增強肺血管順應性，改善肺血管重塑。但作用機制并不明確，由此，我們推測復方葶藶子湯可能通過調控的氧化應激通路影響COPD-PAH的發展。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及實驗條件 清潔級雄性SD大鼠50只，鼠齡10～12周，體重(230±20)g，由湖南省中醫藥研究院動物房，統一向湖南萊斯克實驗動物中心采購[SYXK(湘)2019-0017]。飼養環境保持溫度22～26 ℃，控制相對濕度40%RH～70%RH環境，8～12 h通風換氣1次，采用高溫高壓滅菌飼料及純凈水飼喂。

1.2 實驗藥品 復方葶藶子湯，處方組成：葶藶子15 g，黃芩10 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭6 g，川芎15 g，茯苓15 g，桂枝15 g，白術15 g，矮地茶15 g，甘草6 g。

中藥采用湖南省中醫藥研究院附屬醫院顆粒劑(四川新綠色藥業科技發展有限公司生產)。給藥劑量參考人和動物體表面積折算的等效劑量比率表，大鼠等效劑量相當于人的6.3倍。每只動物每千克按臨床人(70 kg)的等效劑量為中劑量，0.5倍等效劑量為低劑量，2倍等效劑量為高劑量，故低劑量組、中劑量組、高劑量組生藥量分別為 2.56 g/kg、5.13 g/kg、10.26 g/kg。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 將清潔級雄性SD大鼠50只隨機分為5組，每組10只，于右耳相同位置打記號釘標記，分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只大鼠，依次編號并標記。

2.2 模型制備 正常組：大鼠飼養在室溫條件22～26 ℃，相對濕度40%RH～70%RH環境中，飼料予高溫消毒滅菌，不予熏煙、氣管切開滴入脂多糖等操作，灌胃期間給與等劑量的生理鹽水，灌胃劑量10 mL/kg/d。模型組：造模方法同舒家澤等[11]采取熏煙、氣管暴露滴入脂多糖誘發氣道炎癥反應制作慢阻肺相關性肺動脈高壓模型。造模期間(d1～d60)，每日熏煙4 h。第1天水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定大鼠，備皮，切開頸部皮膚，鈍性分離出氣管，肉眼下用眼科剪，斜45°氣管剪開小口。然后用1 mL注射器滴入濃度1 mg/mL脂多糖0.2 mL，豎起固定夾板輕搖，使其充分進入肺部。最后縫合頸部皮膚。第14天重復第1天操作，手術當天不予熏煙處理。中藥(復方葶藶子湯)高、中、低劑量組的大鼠處理同模型組。

煙熏造模結束后次日開始灌胃，連續灌胃14 d。

表1 給藥劑量及方法

2.3 大鼠肺功能測定及肺動脈壓測定

2.3.1 檢測大鼠肺功能 取仰臥位氣管插管，將大鼠放置于小動物肺功能檢測儀內，然后記錄相關肺功能指標包括肺活量(FVC)、0.3秒用力呼氣量(FEV0.3)和FEV0.3/FVC。以驗證慢性阻塞性肺疾病模型建立成功。

2.3.2 檢測平均肺動脈壓 測定平均肺動脈壓(mPAP)術前12 h大鼠禁食無需禁水。給予質量分數10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量按0.3 mL/100 g計算，麻醉后固定大鼠，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離出右側頸內靜脈。將抗凝處理后的導管從頸內靜脈進入，到達肺動脈后固定，活動端連接壓力換能器，接入心電監護系統，待肺動脈壓力波形穩定后，根據監視器所示的壓力波形圖多次記錄肺動脈壓，計算平均肺動脈壓(mPAP)。

2.4 實驗動物處理、取材及標本制備

2.4.1 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 平均肺動脈壓檢測完后，麻醉狀態下，沿前正中線剪開大鼠，用真空采血管采集腹主動脈血，隨后剖取肺組織，取右肺相同部位用生理鹽水沖洗，并用4%多聚甲醛固定備用；剩余部分肺組織置于生理鹽水中保存。多聚甲醛固定的肺組織按矢狀面取材，用酒精脫水，再用蘇木素浸染45 s，沖洗10 min去除多余染色液。然后選擇無水乙醇脫洗，使用伊紅染色液染色10 s。再行組織切片、脫水和包埋。4 μm連續切片，60 ℃烤干。然后脫蠟、水化后HE染色。標本于200倍光學顯微鏡下觀察。

2.5 檢測血清中氧化應激因子 黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠血清中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力值，按照SOD檢測試劑盒說明書操作，加入待測樣本、蒸餾水、酶工作液、酶稀釋液、底物應用液，混勻，孵育20 min，450 nm處用酶標儀讀數。按照如下公式計算SOD抑制率和SOD活力值。

2.6 Elisa檢測血清中環磷酸腺苷(cAMP)的含量 通過腹主動脈采血獲取的大鼠血清樣品首先置于4 ℃冰箱中過夜保存，次日于臺式冷凍離心機上進行離心處理。1000 g離心15 min，溫度6 ℃，隨后取上清液檢測備用。于室溫(約24 ℃)條件下配制洗液，并提前取出酶標板放置30 min。按照順序依次加入標準品和樣品溶液，PBS作為空白對照，加入體積100 μL。然后分別向各孔中加入50 μL的酶標記溶液(注：空白對照孔不加)，隨后用封板膜密封酶標板后置于37 ℃孵育箱中孵育1小時。取出酶標板用濃縮洗滌液清洗酶標板5次，保持各孔水壓，先后加入顯色劑A 50 μL及顯示劑B 50 μL。并于37 ℃避光條件下反應20 min后加終止液50 μL以終止反應，讀取并記錄OD值。然后采用 Curve Expert曲線分析軟件作曲線，以標準品濃度為縱坐標，OD值為橫坐標。根據提示計算標準曲線方程，代入OD值以計算樣本濃度。

2.7 定量PCR檢測 取Trizol保存肺組織約0.02 g，于通風櫥內加Trizol充分研磨，室溫下裂解5 min。隨后加入三氯甲烷200 μL，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min。離心機轉速200HZ，控制溫度于4 ℃，離心15 min后將上層液相轉移到新的RNase-Free離心管中。加入等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min。再將新離心管以200 HZ，4 ℃環境離心10 min去上清，加無菌DEPC水配制的75%乙醇，洗滌沉淀。再一次以200 HZ，4 ℃環境離心3 min去上清。干燥5～10 min。加入20～30 μL無菌無酶水溶解沉淀。最后用紫外分光光度計測定濃度，在260 nm與280 nm處測其吸光度值，計算其濃度跟純度。

2.8 Western Blot檢測蛋白表達 剪取約0.025 g組織樣品，用預冷的PBS洗滌一次，加入300 μL的RIPA裂解液，用生物勻質儀調勻，冰上裂解10 min，4 ℃，200 HZ離心15 min。將離心后的上清液轉移到1.5 mL的離心管中備用。按照分子量分別切膠，將6張與膠同樣大小的濾紙和1張NC膜，一起浸入轉膜緩沖液中。按照濾紙，NC膜，膠，濾紙的順序依次放好。蓋上儀器，接通電源，300 mA恒定電流轉膜，各指標及轉膜所需時間見抗體信息。轉膜之后取出于置于1*PBST中洗1次。通過一抗孵育、二抗孵育，用1*PBST稀釋HRP標記的二抗，按照如下比例稀釋后與膜共同室溫孵育90 min。孵育結束后1*PBST洗3次，每次15 min。

3 統計分析

4 實驗結果

4.1 大鼠的平均肺動脈壓(mPAP) 與正常組比較，模型組及中藥各劑量組的mPAP均升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組mPAP下降(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組mPAP升高；與中劑量組比較，高劑量組大鼠mPAP降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 平均肺動脈壓

4.2 大鼠血清中氧化應激水平 與正常組比較，模型組的血清SOD活力值下降(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組血清SOD活力值升高(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組血清中SOD活力值升高(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組SOD活力值升高(P<0.05)。與正常組比較，模型組及中藥各劑量組血清中MDA含量升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組血清中MDA含量下降(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組血清MDA含量下降(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組血清MDA含量下降(P<0.05)。詳見表3。

表3 血清中氧化應激水平

4.3 大鼠的肺血管組織學改變 HE染色后，于200倍光學顯微鏡下觀察可見，正常組的肺血管內皮連續、管壁薄而均勻、管腔較大且通暢。COPD-PAH模型大鼠的肺血管的內皮不連續，管壁增厚、管腔狹窄血管重構較明顯(如圖1B)。與模型組比較大鼠的肺組織中血管壁變薄、官腔變大，其血管壁變薄及官腔變大程度與藥物劑量呈正相關。

A.正常組；B.為模型組；C.中藥低劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥高劑量組圖1 大鼠的肺血管組織HE染色圖 (×200 光鏡)

4.4 大鼠血清中cAMP含量 與正常組比較，模型組血清中cAMP含量下降(P<0.01)，中藥各劑量組血清中cAMP含量升高(P<0.05)；與模型組比較中藥各劑量組血清中cAMP含量升高(P<0.05)；與低劑量組比較中劑量組血清中cAMP含量升高；與中劑量組比較高劑量組血清cAMP含量升高(P<0.05)。見表4。

表4 血清中cAMP濃度

4.5 Siah2-mRNA相對表達量 與正常組比較，模型肺組織中mRNA相對表達量升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥各劑量組的肺組織中mRNA相對表達量下降(P<0.01)；與低劑量組比較，中劑量組mRNA相對表達量下降；與中劑量組比較，高劑量組mRNA相對表達量下降(P<0.05)。見表5。

表5 肺組織中Siah2-mRNA相對表達量

4.6 Western Blot 檢測蛋白表達水平 與正常組比較，模型組的Siah2蛋白表達增大；中藥各組Siah2蛋白表達均少于正常組及模型組；中藥各組大鼠的肺組織中AKAP-121蛋白的表達均明顯上調。如圖2所示。

圖2 Siah2蛋白、AKAP-121蛋白表達水平圖

5 討論

本課題組提出飲瘀同治法自擬復方葶藶子湯；葶藶子通脈平喘，作為君藥；桂枝、茯苓、白術、甘草取苓桂術甘湯之意以溫化痰飲共為臣藥；桃仁、紅花、水蛭為活血祛瘀，矮地茶止咳平喘均為佐藥，黃芩清熱泄肺為使藥。現代藥理學研究發現葶藶子中有效成分可降低肺循環壓力，減輕肺瘀血，亦可解痙平喘[12]。還有強心、擴張血管的作用，對肺動脈高壓引起的肺心病均具有較好的療效[13]。

氧化應激(oxidative stess，OS)，是指機體組織或細胞內的氧自由基生成增加或清除能力降低，導致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在組織或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程。當肺組織里抗氧化應激的能力下降不足以應付氧化應激因子的攻擊時常導致肺組織和肺血管的損傷[14]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種在機體抗氧化的關鍵生物酶。氧化應激是肺動脈高壓始動因素之一，氧自由基本身及相關產物可損害肺動脈血管的上皮組織，引起肺血管壁細胞的纖維化，肺血管的增厚導致肺動脈高壓形成。環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)參與多種細胞功能的生理調節。Carly Jones等[15]發現，cAMP在肺動脈高壓患者的血清中表達上調，而且細胞外cAMP通路的激活可以抑制肺血管細胞的增殖和肺血管重塑，緩解肺動脈高壓的進展。Siah2(siah E3 ubiquitin protein ligase 2)是泛素連接酶家族的重要成員。研究發現，Siah2與細胞缺氧下的線粒體功能密切相關，主要是因為缺氧會刺激細胞內糖酵解的發生，穩定缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor ，HIF)及其控制相關基因的表達(如Glut1、PDK1)，而Siah2通過調節生理性缺氧下脯氨酰羥化酶的穩定性來激活HIF，從而間接地調節線粒體的功能[16-17]。另一方面，線粒體A激酶錨定蛋白(AKAPs)為一個獨特的蛋白家族，它們與線粒體外膜結合并靶向蛋白激酶A(PKA)[18]。根據C端結構的不同，AKAPs中的AKAP-121在氧化代謝和細胞存活中發揮重要作用。當敲降細胞的AKAP-121的表達會出現嚴重的線粒體結構異常、活性氧的產生增加及線粒體功能的下降等，與肺心病的進展密切相關[19-20]。

丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)是體內自由基與不飽和脂肪酸氧化后的終產物，可反應氧化應激反應對機體細胞的損傷程度，MDA本身還可對線粒體多種酶活性產生影響。實驗結果表明，模型組血清中MDA含量明顯高于正常組，說明在慢性阻塞性肺疾病相關的模型中機體內慢性缺氧狀態可導致氧化應激水平的上調。灌服復方葶藶子湯低、中和高各劑量組的大鼠血清中MDA含量均明顯降低，表明復方葶藶子湯中某些成分可抑制缺氧狀態下氧自由基對細胞的損傷。

SOD和cAMP均是抗氧化因子，cAMP還可以對心肌細胞產生保護作用，細胞cAMP通路的激活可以抑制肺血管細胞的增殖和肺血管重塑，緩解肺動脈高壓的進展[28]。我們發現中藥各組大鼠血清中SOD和cAMP的含量均高于模型組，這表明復方葶藶子湯中的某些成分可以上調SOD和cAMP的表達以達到對抗氧化應激的作用。

Siah2可與多種底物蛋白特異性結合參與多種信號通路分子的傳導調控細胞增殖、分化和凋亡[17]。研究[21]表明AKAP-121表達下調時會出現嚴重的線粒體結構異常、活性氧的產生增加及線粒體功能的下降等，與肺心病的進展密切相關。而氧化應激可激活Siah2誘導AKAP-121的蛋白酶體迅速降解[22]。實驗結果表明，慢阻肺模型大鼠的肺組織中Siah2蛋白表達上調，AKAP-121蛋白表達受到抑制。COPD-PAH模型大鼠的肺組織中的Siah2表達受到抑制下調的程度與復方葶藶子湯的劑量呈正相關，以及 AKAP-121蛋白表達的；HE染色光鏡下模型大鼠的肺組織中血管壁增厚，官腔狹窄，復方葶藶子干預后血管壁變薄，官腔相對擴大；模型大鼠的平均肺動脈壓較正常組升高，中藥干預后可部分降低模型大鼠的平均肺動脈壓。因此認為，復方葶藶子湯可能通過調控cAMP-Siah2-AKAP121通路，減少氧化應激對COPD-PAH大鼠的肺血管壁的損傷，降低肺動脈壓，為臨床上復方葶藶子湯能有效治療 COPD-PAH 患者提供機制支持。