辣椒疫病研究進展

雷 剛，周坤華，陳學軍，黃月琴，袁欣捷，李歌歌，謝媛媛，方 榮

（江西省農業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200）

0 引言

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsiciL.)侵染引起的一種土傳性病害，其會嚴重影響辣椒產量［1-2］。自1922年首次報道以來，辣椒疫病就成為制約辣椒生產的一種全球性毀滅性病害［3-4］，每年在全球造成的損失達100萬美元［5］。辣椒疫病在我國各地均有大面積發(fā)生，尤其南方地區(qū)高溫高濕環(huán)境下，病害更容易暴發(fā)，且危害更為嚴重［1，6］。辣椒疫霉菌宿主廣泛，可經由土壤傳播，具有無性和有性繁殖等特性，這使得通過改變栽培方式、使用化學藥劑等措施的防效甚微［3，7-8］。因此，提高辣椒對疫病抗性的遺傳改良，篩選和培育抗病品種是抵御病害最經濟有效的方式［9］。然而，辣椒對疫病抗性的遺傳復雜，互作機制尚不明晰，導致廣譜抗性的品種不多，因此對辣椒—辣椒疫霉互作的分子機制解析成為本階段研究的重點。本文就辣椒疫病基本情況、疫霉菌致病性和辣椒疫病抗性的研究進展進行綜述，為進一步解析其互作的分子機制提供理論參考。

1 辣椒疫病概述

1.1 辣椒疫霉菌的生活特性

辣椒疫霉菌屬于卵菌綱疫霉屬(Phytophthora)，是一種獨特的類真菌真核微生物，卵菌類植物病原體表現出活體營養(yǎng)性、死體營養(yǎng)性或兩者結合的半活體營養(yǎng)性的生活方式，其中辣椒疫霉是以半活體營養(yǎng)形式生活［10］。辣椒疫霉能夠通過有性和無性方式進行繁殖。因辣椒疫霉屬于雌雄異體，當2種交配型A1和A2相互接觸時，病原體可以進行有性繁殖，產生厚壁卵孢子，這些卵孢子能夠在土壤中存活數年，并在有利的環(huán)境條件下發(fā)芽［11-12］；辣椒疫霉病原體在有利條件環(huán)境下則通過無性繁殖產生大量的無性孢子囊，其直接發(fā)芽或釋放游動孢子感染宿主［13-14］。在我國，辣椒疫霉病原體的無性繁殖在中部地區(qū)占主導地位，而在北方和南方地區(qū)以有性繁殖為主［15］。此外，辣椒疫霉菌宿主廣泛，除了能以葫蘆科［16-20］、茄科［2，21-22］、豆科［23-24］等作物作為宿主，甚至還能侵染木本植物［25-27］等70多種植物［28］，是迄今為止宿主范圍最廣的病原菌［29］。辣椒疫霉菌的這些特性為其生存和快速繁殖提供了條件，同時也給疫病的防控帶來了巨大挑戰(zhàn)。

1.2 辣椒疫病發(fā)病癥狀

辣椒疫霉不僅能侵染辣椒植株的根和莖，引起根、莖腐爛，還能危害葉和果實，導致葉和果實枯萎［30］。辣椒疫霉侵染引起的根腐主要表現為根系變暗，出現小病斑，并迅速擴展到整個根系和莖部，最終導致整個植株萎蔫、死亡，這是辣椒生產中最具破壞性的病害［31］；莖枯則表現為侵染點出現褐色或棕色病斑，隨后蔓延并包圍莖導致莖或整株枯萎、死亡［2］；葉枯主要表現為侵染點出現圓形或不規(guī)則形狀的似“水浸”的病斑，葉色變深，隨后病斑開始擴大，并變成干燥、褐色，最終蔓延至莖部，并伴隨病葉脫落［31-32］；辣椒果實發(fā)病多從果蒂或果尖處開始向另一端蔓延，病斑起初為不規(guī)則的水漬狀，很快擴展至整個果實［33］，導致果實變褐，果肉軟腐，隨后果實感染組織失水、干縮變成黃褐色或淺棕色。

1.3 辣椒疫病主要防控手段

高溫高濕環(huán)境有利于辣椒疫霉菌的傳播［12，34］，長期濕度飽和適宜溫度的土壤有利于疫霉菌侵染引起的根腐病的發(fā)生［31］；疫霉菌侵染導致的葉枯病和莖枯病多發(fā)生在相對空氣濕度高的地區(qū)和春、秋季多雨的時期，降雨和不科學的灌溉可能是使病原菌從土壤中傳播到地上部分的重要媒介［12，35-36］。在生產實踐中，首先可通過合理灌溉、合理密植、輪作、土壤消毒、煙熏等來限制病原菌的傳播，創(chuàng)造不適宜病原菌生長的環(huán)境［29］；其次，噴施化學殺菌劑，如苯酰菌胺、甲霜靈、烯酰嗎啉等為目前辣椒疫霉菌防治的重要手段；再次，培育抗性品種被認為是抵御病害最經濟有效的方式［9］，然而當前的一些抗疫病品種是對某一地區(qū)或特定生理小種的抗性，且由于商業(yè)品種的單一化種植和病原菌新毒性基因的產生等原因，往往會導致品種抗病性的喪失［37］。因此，深入研究辣椒疫病抗原，培育廣譜抗性的新品種是疫病防控的重要方向。

2 辣椒疫霉菌致病機制

2.1 基于效應子的致病機制

效應子(effectors)是由病原菌分泌以操縱宿主細胞結構和功能，從而促進感染和/或觸發(fā)防御反應的病原體分子［38］。當植物遭遇病原菌侵染后，先通過識別病原體相關分子模式(Pathogen/microbeassociated molecular patterns，PAMPs/MAMPs)引起模式觸發(fā)的免疫(Pattern-triggered immunity，PTI)，進而引發(fā)過敏性細胞壞死和防御反應；但疫霉菌已經進化出可以鎮(zhèn)壓或逃避PTI的效應子，而植物則利用抗病基因產物來識別效應子以激活效應子觸發(fā)的免疫響應(Effector-triggered immunity，ETI)，引發(fā)過敏反應和相關防御響應。參考文獻［39-56］可知，效應子按作用部位分為質外體效應子和細胞質效應子，其作用機制和功能也不盡相同，近年來鑒定的辣椒疫霉菌效應因子及其功能見表1。

表1 辣椒疫霉菌效應子及其功能

2.1.1 質外體效應子 質外體效應子主要包含細胞外毒素、水解酶和抑制劑等，其中有關細胞外毒素，如壞死和乙烯誘導肽類似蛋白(Necrosis and ethylene inducing peptide-like proteins，NLPs)家族和富含半胱氨酸小分子(Small cysteine-rich，SCR)蛋白家族在辣椒疫霉中研究較多。phcnlp1屬于辣椒疫霉NLPs蛋白家族基因，在疫霉菌侵染后的癥狀發(fā)展過程中表達增加，引起煙草植株明顯的壞死［39］。Feng等［40］利用qRT-PCR方法檢測了P. capsici感染后11個PcNLP基因在不同時間點的表達譜，發(fā)現PcNLP2、PcNLP6和PcNLP14在侵染過程中表達量最高，且在辣椒和煙草中引起最大的黃化或壞死區(qū)域，表明其在P. capsici侵染過程中的強毒力。隨后，通過對辣椒疫霉NLP基因家族進行分析，Chen等［41］鑒定了辣椒疫霉的65個NLPs基因，其中Pc11951、Pc107869、Pc109174和Pc118548編碼蛋白能夠誘導辣椒和煙草植株細胞死亡。SCR蛋白家族在病原體—植物互作中發(fā)揮重要作用。辣椒疫霉scr82基因在菌絲體、孢子囊和游動孢子階段表達微弱，但在感染開始時迅速上調，其過表達增加了病原體的毒力和對氧化應激的耐受性，而scr82敲除導致P. capsici的毒力嚴重受損和抗氧化應激能力顯著降低［42］。此外，激發(fā)素(Elicitins)是一種結構相關的細胞外蛋白家族，在煙草中誘導過敏性細胞死亡和產生其他防御相關的生化變化［43］。辣椒疫霉編碼激發(fā)素的基因PcINF1瞬時過表達觸發(fā)辣椒細胞死亡，同時伴隨過敏反應誘導基因1(HIR1)和發(fā)病相關基因的表達；進一步研究發(fā)現，其表達產物PcINF1與辣椒SRC2-1構成的膜靶向復合物PcINF1-SRC2-1是觸發(fā)細胞死亡所必需的［44］。含CBM1結構域蛋白(CBPs)在植物—微生物相互作用中起著關鍵作用，被植物識別為微生物相關分子模式(MAMPs)。辣椒疫霉PcCBP3是一個質外體效應子，參與誘導油菜素類固醇不敏感相關受體激酶1(BAK1)依賴的細胞死亡過程［45］。

2.1.2 細胞質效應子 由疫霉菌分泌后轉移至宿主細胞內發(fā)揮作用，主要包含RxLR和皺縮壞死蛋白(crinkling and necrosis，CRN)效應子［46］。RxLP效應子因包含1個保守的氨基酸基序(Arg-Xaa-Leu-Arg)，即RxLR基序而得名，辣椒疫霉菌基因組編碼400個RxLR效應子［47］，其通常與宿主細胞中的靶向基因互作，通過行使以下3個方面的功能增加其致病能力：(1)鎮(zhèn)壓宿主免疫響應。辣椒疫霉菌效應子RXLR242能夠通過靶向宿主多個RAB(Rasassociated binding)蛋白，如RXLR242與RABE1-7的競爭性相互作用抑制了囊泡相關蛋白復合物的形成和病程相關蛋白1(Pathogenesis-related protein 1，PR1)的合成，其次RXLR242還競爭性地靶向RABA4-3蛋白干擾膜受體FLS2(flagellin-Sensing)的轉運，進而影響宿主的免疫響應［48］。RXLR25效應子則直接靶向宿主細胞質類受體激酶亞家族Ⅶ(Receptor-like cytoplasmic kinase subfamily Ⅶ，RLCK-Ⅶ)蛋白，抑制模式誘導的RLCK-Ⅶ磷酸化以鎮(zhèn)壓下游免疫反應［49］。辣椒疫霉菌的RxLR效應子PcAvh103通過靶向宿主EDS1(Enhanced Disease Susceptibility 1)破壞EDS1-PAD4(Phytoalexin Deficient 4)復合體，進而抑制植物的免疫響應［50］。(2)增加宿主對病原菌的敏感性。辣椒疫霉RxLR效應子PcAvr3a12在侵染期與包含肽基脯氨酸順反異構酶(PPIase)活性的FKBP15-2互作，抑制其免疫響應活性，增加植物對病原菌的敏感性［51］。辣椒疫霉RxLR效應子PcAvh1與調控植物免疫和生長的蛋白磷酸酯酶2A亞基(PP2Aa)互作而促進病原菌的侵染［52］。(3)誘導宿主細胞死亡。擬南芥ACD11與BPA1及其同源物互作，在ROS穩(wěn)態(tài)和防御反應中發(fā)揮重要作用。研究表明辣椒疫霉效應子RxLR207可促進BPA1、BPL1、BPL2和BPL4的降解，以26S蛋白酶體依賴的方式破壞ACD11的穩(wěn)定性，從而激活ROS介導的細胞死亡［53］。

細胞質內另一類效應子CRN以宿主細胞核為靶點，通過抑制相關基因的表達來影響宿主免疫響應［46］。辣椒疫霉CRN效應子PcCRN4由質外體轉運至宿主細胞核，并通過抑制宿主病程相關基因的表達鎮(zhèn)壓其抗性，通過操縱細胞死亡相關基因的表達誘導宿主細胞死亡［54］。在植物中過表達效應子蛋白基因PcCRN83_152引起宿主細胞死亡，同時增強病原菌的毒力，進一步研究發(fā)現其毒性功能和誘導細胞死亡是獨立的［55］。

2.2 其他與致病相關的因子

大量分泌效應物是植物病原體致病性的一個重要方面［57］，然而部分與疫霉菌生長、發(fā)育相關的因子也被報道影響其毒力和致病性［58］。辣椒疫霉PcAPT1參與調控菌絲生長、磷脂酰絲氨酸的跨膜轉運及水解酶分泌，其敲除菌株表現出明顯降低的致病力［58］。與之相似的是，高親和性磷酸二酯酶PcPdeH、疫霉菌纖維素合酶PcCesA1、PcLRR-RK1和幾丁質合酶PcCHS也被報道參與辣椒疫霉菌營養(yǎng)生長、孢子萌發(fā)和發(fā)育過程，同時對致病性至關重要［59-62］。此外，辣椒疫霉果膠裂解酶基因PcPL1、PcPL15、PcPL16和PcPL20表達產物可以增加病原菌毒力，促進其侵染和誘導宿主細胞死亡［63］，而果膠甲酯酶PCPME6通過降解宿主細胞壁來促進病原菌侵染，最終導致壞死病斑的產生［64］。辣椒疫霉菌PcFtsZ2蛋白是其無性繁殖和侵染宿主所必需的，PcFtsZ2基因沉默抑制了侵襲性結構的生長和發(fā)育，極大地抑制了病斑的發(fā)展［65］。轉錄調節(jié)因子PcNmrAL1被報道與生物營養(yǎng)標記基因PcHmp1(吸器膜蛋白1)共表達，除了控制轉錄、翻譯和氮代謝的因素外，還有助于調節(jié)病原菌中大量效應因子基因的表達，介導生物營養(yǎng)向壞死營養(yǎng)的轉變，驅動作物疫霉病周期［66］。編碼多肽的小開放閱讀框(Small open reading frame-encoded polypeptides，SEPs)參與生命體對環(huán)境的響應，在辣椒疫霉菌中，PcSEP1在質外體發(fā)揮作用，促進病原菌侵染和誘導宿主細胞死亡［67］。

3 辣椒疫病抗性機制

3.1 辣椒疫病抗性位點

辣椒對疫病的抗性主要包含由單一顯性基因和數量性狀位點(QTL)控制的遺傳模型。研究表明，單一顯性基因主要是對疫霉菌生理小種的特異性抗性［31，68-71］，然而辣椒對疫霉菌的抗性是一個由多基因控制的復雜性狀，截至目前已鑒定大量的抗病相關的QTLs，遍布所有辣椒染色體，但絕大多數位點均集中在5號染色體(表2)。Lefebvre等［72］于1996年報道了首張基于DH群體的辣椒疫病抗性遺傳圖譜，鑒定了13個抗性QTLs，其中1個位于5號染色體(P5)的QTL對抗性有主要影響，解釋了總方差的41%～55%。此后，大量研究通過利用不同的雙親和遺傳群體、作圖策略證實了位于5號染色體的這些QTLs［73-76］。在此基礎上，Mallard等［71］開發(fā)標記對遺傳圖譜中5號染色體上的QTLs區(qū)間進行錨定，并結合Meta分析檢測到3個連續(xù)的QTLs：Pc5.1(R2=10.50%～52.72%)、Pc5.2(R2=6.71%～12.96%)和Pc5.3 (R2=8.50%～27.67%)；其中，Pc5.1在來自4個抗性品系的6個子代中被檢索到，且對不同地理來源的12個菌株具有廣譜抗性。Liu等［77］通過BSA技術將單位置多態(tài)性(SPP)標記(Phyto5SAR)標記到位于辣椒P5的主效 QTL上，并在包含Phyto5SAR的scaffold194上鑒定到2個潛在的抗性基因NBS-LRR和SAR8.2A。隨后，Wang等［78］將抗性基因定位到5號染色體上3.2cM的區(qū)間，結合基因注釋信息和轉錄表達數據鑒定到Capana05g000764 和Capana05g000769 這2個候選基因。結合傳統QTL作圖與GWAS技術，Siddique等［79］在辣椒5號染色體上定位了3個不同來源菌株產生廣譜抗性的3個主要效應位點(5.1、5.2和5.3)，并在QTL作圖和GWAS共同區(qū)域預測了候選核苷酸結合位點基因簇：富亮氨酸重復序列(NBS-LRR)和類受體激酶(RLK)。利用先前報道的分子標記對5號染色體上的主要QTL區(qū)域 (6.2～139.2 Mbp)重新分析，Kim等［80］鑒定到候選抗性基因類似物，包括14個核苷酸結合位點的富亮氨酸重復序列、3個受體樣激酶和1個受體樣蛋白基因。Du等［81］將遺傳標記固定在辣椒基因組序列上，構建了1個覆蓋所有已報道的Pc5.1的擴展Pc5.1(Ext-Pc5.1)，結合轉錄數據發(fā)現區(qū)間內44個差異表達的基因均未見報道，其中抗菌肽-1基因 (SN1)可能是與抗病性有關的候選基因［82］。這些QTLs的鑒定為辣椒疫病抗性基因的克隆和抗性篩選標記的開發(fā)奠定了基礎。

表2 已報道的辣椒疫病抗性QTLs

3.2 辣椒疫病抗性相關基因和基于組學的抗性遺傳網絡研究

目前，通過抗性QTLs發(fā)掘并鑒定的抗性基因還有限，但許多功能涉及辣椒對疫霉菌防御反應的基因已經被報道。幾丁質酶蛋白基因CaChi和聚半乳糖酶抑制蛋白基因CaPGIP1可以直接抑制辣椒疫霉菌的生長［90-91］，并通過減少活性氧(ROS)的積累，觸發(fā)超敏反應(HR)和防御相關基因的上調來增強對辣椒的抗性［91-92］。乙烯反應因子基因CaAP2/ERF064和CaPTI1負責觸發(fā)細胞死亡，并參與茉莉酸/乙烯(JA/ET)信號通路，調節(jié)CaBPR1、CaBPR1、CaDEF1和CaSAR82的表達［93-94］。然而，SBP-box家族CaSBP08、CaSBP11和CaSBP12基因沉默植株表現出對疫霉菌的抵御能力增強，伴隨著防御相關基因被強烈誘導，細胞損傷降低，表明這些基因對辣椒植株抵御疫霉菌侵染的防御反應具有負調控作用［95-97］。此外，CanPOD［98］、CaRGA2［99］、CaDIR7［100］和CaCIPK1［101］等基因也被報道可增強辣椒植株對疫病的抗性。雖然以往的研究有助于更好地了解辣椒對疫霉菌侵染的分子機制，但對參與防御的基因及其遺傳網絡的研究成果較少。

辣椒對疫霉菌的抗性是一個高度復雜的性狀［12］。對于復雜的性狀，關聯信號往往分布在基因組的大部分區(qū)域，包括許多與抗病性沒有明顯聯系的基因，但其在細胞中表達容易影響抗病相關核心基因的功能［102］。因此，開展辣椒疫病抗性遺傳網絡研究對系統揭示其抗性分子機制具有重要意義，但有關辣椒響應疫霉菌侵染機制和途徑的研究有限。在最近的一項研究中，Li等［103］利用轉錄組技術分析了疫霉菌接種后抗性和易感辣椒根系在不同時間點的基因表達變化，發(fā)現在抗性材料中，苯丙烷類生物合成途徑相關基因被顯著誘導，表明苯丙類生物合成途徑在辣椒根抗性中起著重要作用。另一項基于疫霉菌侵染的辣椒葉片的轉錄組研究揭示了與防御和信號響應相關的基因與分子功能、細胞成分和生物過程的共同協調參與辣椒對疫霉菌侵染的響應［104］。Rabuma等［105］研究了疫霉菌侵染過程中敏感和抗性辣椒基因型中的miRNA及其靶基因變化，其中30個靶基因與防御相關，進一步驗證了8個靶基因和miRNA之間的關系，這為更好地理解辣椒疫病抗性的轉錄后調控機制提供了有價值的資源。

4 展望

疫霉菌侵染辣椒組織，同時辣椒對疫霉菌的入侵進行抵御，是一個相互作用的復雜過程。在此過程中，PAMP被細胞表面受體識別并觸發(fā)PTI，啟動應對病原菌入侵的第一道防線；此時疫霉菌分泌效應子以鎮(zhèn)壓或逃避PTI，宿主則通過對應的策略識別效應子并觸發(fā)ETI，引起相關基因的表達、代謝物的積累及過敏反應等建立第二道防線。目前，大量的疫霉菌效應子及其靶向的宿主蛋白已經被鑒定，但辣椒中識別PAMP和效應子的受體還鮮有報道。自辣椒疫病發(fā)現以來，對其抗性機制的研究已取得了豐碩成果，大量的抗性位點被鑒定，然而這些位點大多以CM334、Perennial、PI201234等幾個材料作為抗性親本構建群體，此外還未鑒定出廣譜的抗性位點，對已知位點內的基因挖掘和功能研究仍然有限。辣椒對疫病的抗性是高度復雜的性狀，受多基因的共同作用，許多重要的基因座通常效應較小。因此，通過大規(guī)模資源抗性鑒定，利用全基因組關聯分析(GWAS)來彌補傳統QTL定位的不足，鑒定一些小效應的重要基因座。隨著高通量組學技術的快速發(fā)展，綜合利用多組學數據，從基因、RNA、蛋白、代謝，甚至表觀遺傳，如DNA修飾(甲基化)、RNA編輯、組蛋白修飾等多層面對辣椒—疫霉菌互作機制進行系統深入的研究，將有助于闡明辣椒疫病抗性的分子機制。