滇池藻毒素時空分布特征及其與環境因子的相關性分析

羅 婧，陶 冕，李 沖，李濤燕，王紹艷，蔣昌李，程云軒，段平洲

1. 中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

2. 昆明市城市排水監測站，云南 昆明 650500

藍藻水華一直以來是困擾水環境治理的重要“頑疾”，其中主要表現在藍藻水華會產生多種藍藻毒素，其在水體中分布、遷移及轉化進一步影響水環境安全[1-2]. 微囊藻毒素(Microcystins，MCs)為富營養化湖泊中最常見的一種天然毒素，由于檢測方法復雜，檢測時間較長，致使MCs 產生并釋放到飲用水或娛樂用水中，同時對水產品(魚類、貝類等)食用安全性的影響威脅到我國人民的健康[3-5]. 目前已經發現的MCs 異構體近百種，最常見的有MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY，其中L、R、Y、F、W 分別代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸. 世界衛生組織推薦的飲用水MCs 限量不超過1 μg/L，MC-LA、MC-LR、MC-YR、MC-RR 被美國環境保護局(US EPA)列為重點監測和控制對象[6].

已有大量的研究報道了我國湖泊和水庫中MCs的賦存情況，中部地區太湖和鄱陽湖MCs 的最大平均濃度分別為1.00 和1.26 μg/L[7-8]，華北地區官廳水庫和洋河水庫分別為4.32 和0.98 μg/L[9]. 而以滇池為代表的云南高原地區湖泊MCs 污染較為嚴重，已經成為制約當地經濟社會發展的重要環境問題之一[10-12].滇池是我國污染較為嚴重的湖泊，其富營養化導致水質下降、藻華頻發以及主要生物類群發生劇變，造成水生生態系統受到嚴重破壞，促進了MCs 產生[13-17].葛思敏等[18-19]對滇池MCs 時空分布的初步研究和分析表明，滇池水體中MCs 濃度明顯較高. 但這些研究局限于滇池的部分區域和時間段，關于滇池整體MCs 濃度的季節性變化和相關性研究還鮮見報道.因此研究滇池藻類污染，防范MCs 給水環境及人類健康帶來的威脅已迫在眉睫[20-21]. 在滇池水生態嚴重退化條件下，開展滇池MCs 監測分析和影響因素研究，以期為滇池飲用水源地保護和探究MCs 產生規律提供科學依據.

雖然現有研究對MCs 含量和種類的影響因素有了較為廣泛的研究，但大多數是基于實驗室培養的模擬數據，復雜背景下的野外觀測較少，而且監測的MCs 種類有限，很少針對多種MCs 含量從水體理化性質因素的整體角度進行分析[22-23]. 已有研究表明，鄱陽湖水環境中MCs 濃度與藍藻生物量、溫度、TN濃度和TP 濃度均呈顯著正相關[24]，但在其他湖區MCs 的影響因子卻明顯不同，這可能是由于不同湖泊具有不同的氣候和水文特征[25]. 因此，需要對滇池MCs 產生的環境因子進行深入探究. 另外，對于MCs生態風險的研究迫切需要一套可以同時檢測多種MCs 的分析方法，短時間內對自然水體進行高效、精準、靈敏地定量分析，在藍藻水華暴發的背景下及時提供水體的毒性預警，可為相關主管部門快速研判水體中痕量微囊藻毒素的污染狀況、主要優勢異構體的鑒別提供方法保障，同時為MCs 的暴露風險評估、保障人體健康路徑和城市供水預處理工藝研究提供必要的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 研究區域

滇池流域位于云貴高原中部(102°29′E~103°01′E、24°29′N~25°28′N)，地處云南省昆明市南部. 滇池的平均水體深度為5.3 m，湖體面積達309.5 km2，分為草海和外海，它們相互連接卻又幾乎不可互換，其中滇池的主體為外海. 流域面積為2 920 km2，湖體庫容為15.6×108m3，有2 個下泄水出口. 多年平均入湖水資源量為9.7×108m3，2013 年實施了牛欄江-滇池補水工程，年均補水量為5.6×108m3. 常年匯入滇池的河流有35 條，其中面積大于100 km2的有盤龍江、洛龍河、寶象河(新寶象河)等10 條河流；面積介于50~100 km2之間的有新運糧河、東白沙河(海河)、馬料河、南沖河、淤泥河等5 條河流；面積介于10~50 km2之間的有老運糧河、采蓮河、大清河、枧槽河、廣普大溝、金汁河、中河(護城河)、古城河8 條河流；面積小于10 km2的有烏龍河、大觀河、西壩河等12條河流.

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑

主要試劑包括甲醇(色譜級，Fisher)、乙腈(色譜級，Fisher)、甲酸(質譜級，Waters)、MCs 標準品(MC-RR、MC-LR、MC-YR、MC-WR、MC-LA、MC-LF、MC-LY、MC-LW)(95%, Bepure)、超純水(娃哈哈)、親水性混合纖維素酯過濾膜(0.22 μm，杭州特種紙業有限公司)和20 mL 滅菌一次性注射器.

1.2.2 儀器

主要儀器包括超高效液相色譜儀-三重四極桿質譜儀(UPLC-MS/MS，美國沃特世公司)、ACQUITY UPLC BEH C18 分析柱(1.6 μm，2.1 mm×50 mm，美國沃特世公司)和Oasis HLB Direct Connect HP 在線固相萃取柱(21 mm×30 mm，20 μm，美國沃特世公司).

1.2.3 儀器條件

上樣體積：5 mL，水樣先經過0.22 μm 濾膜過濾后直接上樣.

在線固相萃取方法(四元泵)：0.5%甲酸-水溶液(流動相B)，0.1%甲酸-乙腈/甲醇(體積比為90∶10)溶液(流動相C)，甲醇/丙酮/正己烷(體積比為1∶1∶1)溶液(流動相D). 萃取程序：0~0.5 min，100%流動相B；0.5~3.8 min，95%流動相B + 5%流動相C；3.8~4.1 min，100%流動相D；4.1~7.0 min，5%流動相B + 95%流動相C；7.0~11.0 min，100%流動相B.

梯度洗脫程序設置(二元泵)：0.1%甲酸-水溶液(流動相A)，0.1%甲酸-乙腈/甲醇(體積比為90∶10)溶液(流動相B). 洗脫程序：0~3.8 min，95%流動相A+5%流動相B；3.8~7.0 min，5%流動相A+95%流動相B；7.0~9.0 min，95%流動相A+5%流動相B；9.0~11.0 min，5%流動相A+95%流動相B.

質譜條件：正離子掃描；多反應監測(MRM)模式；電噴霧離子源(ESI)；毛細管電壓3.70 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔氣流量50 L/h；錐孔氣壓30 V；碰撞氣流量0.06 mL/min. 8 種MCs 的質譜參數如表1 所示.

1.3 樣品采集

a) 監測點布設. 本研究采用昆明市城市排水監測站布設的滇池湖體監測點，包括滇池全湖23 個自動或人工加密監測點位以及10 個國控監測點位，其中草海5 個、外海28 個. MCs 濃度監測采樣布點情況如圖1 所示.

圖1 滇池湖體采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling points in Dianchi Lake

b) 樣品采集與保存. 采樣時間為2022 年2 月、5 月、8 月和11 月. 用2.5 L 玻璃采水器采集水下50 cm水樣. 所有樣品冷藏狀態下及時送至實驗室，取1 L水用于測定微囊藻生物質濃度，另500 mL 用于測定MCs 濃度.

1.4 質量控制與數據分析

在滇池湖水中加標10、100 和1 000 ng/L 濃度的MCs 標準溶液，每個濃度水樣平行測定6 次，計算回收率及相對標準偏差，水中8 種MCs 的加標回收率大于90%，相對標準偏差小于10%，說明該方法可滿足實際水樣檢測.

利用中國科學院資源環境科學數據中心(http://www.resdc.cn)2015 年中國土地利用遙感監測數據提取滇池水體邊界，分辨率為30 m×30 m. 借助ENVI 5.1、ArcGIS 10.8 軟件進行空間裁剪、掩模、重分類，將采集監測MC 濃度數據導入影像，建立MCs 濃度時間和空間序列柵格數據集，揭示滇池MCs 濃度的時空分布規律.

測定各采樣點平行樣，取平均值. 使用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，包括方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)測驗環境因子與MCs 濃度的時空差異，采用并通過Pearson 相關性分析研究MCs 濃度與環境因子的關系(P>0.05 時相關性不顯著，P<0.05 時相關性顯著，P<0.01 時相關性極顯著). 使用Origin 2018 軟件繪制濃度柱狀圖，使用ArcGIS 10.8繪制空間分布圖.

2 結果與分析

2.1 MCs 檢測方法的準確度與回收率

本研究建立了在線固相萃取-超高效液相色譜質譜法聯用測定地表水中8 種MCs 的檢測方法. MCs檢測方法優化后8 種MCs 的保留時間(min)、線性范圍(ng/L)、相關系數(R2)、檢出限(limit of detection,LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)、回收率(%)和相對標準偏差(%)如表2 所示. 8 種MCs 在5~1 000 ng/L 的范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，8 種MCs 的回收率均大于90%且相對標準偏差均小于5%，定量限(LOQ)為0.082~0.297 ng/L，均低于GB 3838——2002《地表水環境質量標準》對MC-LR 規定的標準值(1.0 μg/L). 與已有文獻[26-27]相比，該方法測試時間短(11 min)，靈敏度高，準確性強，能夠為實時、快速監測富營養化水體中MCs 污染狀況提供科學的分析方法，為飲用水源地的健康風險預警提供參考.

表2 8 種MCs 檢測方法的準確性指標Table 2 Accuracy index of 8 MCs detection methods

2.2 滇池MCs 時空分布規律

2.2.1 滇池MCs 的污染程度分析

本文以滇池2022 年全年的MCs 為研究對象，探索其時空分布規律. MC-RR、MC-LR、MC-WR 和MC-LW的檢出率最高，均為100%；MC-LA、MC-LF 的檢出率較高，分別為94.6%和93.9%；MC-LY 和MC-YR的檢出率較低，分別為46.6%和48.6%. 2022 年2——11 月滇池水體中8 種MCs 的污染程度如圖2 所示.由圖2 可見，滇池MCs 濃度呈現明顯的季節性變化規律，即冬季最低，2022 年2 月MCs 總濃度范圍為16.271 6~122.847 0 ng/L；春季快速上升，MCs 總濃度范圍為51.263 0~1 245.258 3 ng/L；夏季最高，8 月MCs總濃度范圍為141.547 5~896.803 7 ng/L；秋季較高，MCs 總濃度范圍為28.473 3~409.177 5 ng/L. MCs 的總濃度峰值出現在5 月，但8 月的MCs 濃度平均值(511.101 9 ng/L)要高于5 月(447.469 3 ng/L). 據國家地表水水質自動站監測的結果顯示，滇池水體中營養鹽在冬季和春季處于最低水平，夏季和秋季含量較高. 因此冬季水溫較低以及營養鹽因子的限制作用，影響了藻類生長，減少了MCs 的釋放；春季隨著溫度的升高，藻類開始快速生長并向水體中釋放MCs；夏季為滇池藍藻水華暴發的高峰期，2020 年9 月衛星遙感監測到滇池發生一次大規模水華，因此具有較高的MCs 濃度平均值[18]；秋季隨著溫度降低，藻類快速死亡，MCs 濃度迅速降低，但由于溫度小幅波動或回升，導致藻類緩慢生長，因此部分區域的MCs 濃度還維持在較高水平.

圖2 滇池MCs 的污染情況Fig.2 MCs pollution amount in Dianchi Lake

綜合近年來對滇池MCs 的研究可知，2003 年MCs 最高濃度為1.16 μg/L[28]，2009 年8 月——2010 年7 月MCs 總濃度在0.17~1.03 μg/L 范圍內[29]，2014 年1 月和3 月MCs 的總濃度分別為9.28 和5.55 μg/L[30]，2020 年第3 季度MCs 總濃度平均值為2.412 μg/L[18].其他高原湖泊如洱海，MCs 主要種類為MC-LR 和MC-RR，MC-LR 最高值(3.657 μg/L)出現在8 月，最低值(0.056 μg/L)出現在2 月[29]，這與滇池MCs 的季節分布和種類組成非常相似. 近年來，滇池的藍藻水華防治工作取得了重大進展[31]，MCs 的平均濃度顯著下降，但在部分點位MCs 濃度仍會超過1.0 μg/L的警戒值，因此需要加強滇池水質監管和水華應急管理，保障居民的人體健康.

2.2.2 滇池MCs 的組成分析

如圖3 所示，對滇池MCs 總含量貢獻最高的是MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR，但隨著季節有所波動和變化. 在冬季，MC-LW 占比(37.35%)最高，其次為MC-LR(23.54%)和MC-RR(13.12%)；隨著溫度升高，MC-LR 的占比快速增高，在春季和夏季均超過50%，MC-LW 占比快速降低，而在秋季時再度上升；MC-RR 和MC-WR 的占比則較為穩定. 推測主要有三方面原因：①溫度或水環境因子變化導致的藻類種群結構發生變化，從而改變了MCs 的組成成分[32-33]；②溫度或水環境因子變化導致MCs 合成或釋放的基因受到影響從而改變MCs 的組成成分[34-35]；③不同MCs 分子具有不同的熱穩定性或水解特性[34]，從而影響了其在水環境中的賦存. MC-LR 在藍藻水華暴發期貢獻最高，因此可作為滇池MCs 的重點關注因子，同時MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR 可作為環保部門的重點關注對象.

圖3 滇池MCs 成分分析Fig.3 Composition analysis of MCs in Dianchi Lake

2.2.3 滇池MCs 時空分布規律

本文以滇池4 個季節MCs 為研究對象，探索其時間空間的分布規律. 如圖4 所示，滇池的MCs 濃度分布具有明顯的時空差異性和顯著規律. 在秋冬季MCs 濃度總體處于較低水平，但在中部的觀音山西-觀音山中區域檢測出了較高的MCs 濃度，呈現出南北低、中部高的分布特征. 而在春夏時節，MCs 的總體濃度都處在較高水平，重污染的區域分布較為相似，集中在滇池中部區域(包括觀音山西、觀音山中、觀音山東和撈魚河濕地)和北部區域. 不同的是，春季時草海的MCs 濃度較低而外海北部(福保灣、灰灣西、灰灣中)整體較高；而夏季時，外海和草海MCs濃度都較高，外海中部和南部的MCs 濃度明顯升高[19].

圖4 滇池MCs 濃度時空分布特征Fig.4 Temporal and spatial distribution characteristics of MCs in Dianchi Lake

除夏季外，草海水域的MCs 濃度均顯著低于其他區域. 夏季烏龍河口(894.1 ng/L)和斷橋(877.4 ng/L)的濃度最高，這可能是由于產毒微囊藻在8 月時大量死亡，使MCs 大量釋放到水體中；而在外海北部和南部，春季的MCs 濃度高于夏季，則主要是由于水流較慢造成MCs 的累積；滇池中部區域四季MCs 的濃度均較高，這可能是由于滇池常年自西南向東北的風向，以及自草海向外海的水力流場綜合作用的結果，造成了MCs 在中部的匯聚，同時觀音山對MCs 的擴散起到了一定的阻礙作用.

2.3 MCs 與生物和環境理化因子的相關性分析

研究表明自然水體中產生的MCs 來源于藍藻細胞，因此本文分析了濃度較高的6 種MCs 與生物因子(藻細胞密度、Chla)以及水體理化因子之間的相關性，以上數據來源于2022 年滇池10 個國控點位的監測結果. 根據2.2.2 節對MCs 分布規律和成分占比的分析，可以發現MC-LR 貢獻最高，占比最穩定，因此作為重點關注對象，相關性分析時以MC-LR 作為代表性因子. 分析結果(見表3)顯示，在生物因子方面，滇池MC-LR 與藻細胞密度具有顯著的負相關關系(P<0.05)，這是由于MC-LR 在產毒微囊藻死亡后才會釋放到水體中，此時藻細胞已大量死亡或沉積到湖底，而在本研究中采集的是上層水體樣品，因此MC-LR 濃度的升高與生物量的最大值間具有一定的滯后性，這也解釋了滇池春季藻細胞密度最高以及MC-LR 最高濃度出現在夏季的原因[36]；同時，MC-LR 濃度與Chla 濃度之間具有極顯著的正相關關系(P<0.01)，Chla 反映了水體中藻類的豐度、生物量和變化規律，因Chla 也采集于上層水體，MC-LR和Chla 同源且同時受到風向和水力條件的影響，所以二者的相關性很高. 滇池MC-LR 濃度與藻細胞密度的相關性和太湖、鄱陽湖的研究結論存在較大差異[25,29]，這是由于滇池常年自西南向東北的風向，以及特殊的地面流場和水流特性造成的[37]，加之滇中引水工程顯著加快了草海的水體交換速率，而太湖和鄱陽湖的大部分區域水體流動相對緩慢，造成了滇池在驅動因子上的差異.

表3 滇池MCs 濃度與生物和理化因子之間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between concentration of MCs and biological/physicochemical factors in Dianchi Lake

冬季藻類具有從北向南遞增的趨勢，滇池南監測點的藻密度最大；滇池春季藻類呈現北部和南部高、中部低的趨勢，其中點位滇池南的藻密度最大，點位白魚口和草海中心的藻細胞密度最低；夏季藻密度呈現從北向南遞減的趨勢，其中點位滇池北的藻密度最大，點位白魚口的藻密度最??；秋季藻密度呈現從北向南遞增的趨勢，其中點位灰灣的藍藻密度最大，點位草海的藍藻密度最小[16]. 可以看出，滇池MCs 濃度隨著藻密度升高而呈現降低的趨勢.

同時，MC-LR 的產生也受到水體的理化因子影響，因此本文分析了MC-LR 與營養鹽(COD、NH4+-N、TP、TN、高錳酸鹽指數、BOD5)和理化指標(pH、DO、透明度)的相關性，結果如表3 所示. MC-LR 濃度與COD 濃度無顯著的相關性，與NH4+-N 濃度呈顯著正相關(P<0.05)，與TP 濃度呈極顯著正相關(P<0.01)，與TN 濃度呈顯著負相關(P<0.05)，與pH 和DO 濃度均無顯著的相關性，與高錳酸鹽指數呈顯著正相關(P<0.05)，與BOD5呈極顯著正相關(P<0.01)，與透明度呈顯著正相關(P<0.05). 上述結果表明，光照強度(透明度)和營養鹽(氮、磷、有機物)是控制滇池MC-LR 產生的重要因子，這與前人對滇池的研究結果[38-39]類似. 其中，TP 對藻類生物量的增加起到顯著作用，這與大部分研究的結果[40]一致. MC-LR 濃度與BOD5的相關性明顯高于COD 濃度和高錳酸鹽指數，說明可生物利用的營養物質是藻類繁殖的主控因子. MC-LR 濃度與NH4+-N 濃度之間具有顯著的相關性，很可能是由于入滇河流承接了城鎮污水和面源污染，MCs 濃度高的區域均有入滇河流的分布. 另外，MC-LR 濃度與TN 濃度呈顯著負相關，這可能是由于TN 濃度升高會顯著地抑制TP 從沉積物中釋放[41-42]，而隨著多項水質凈化工程的建設，內源污染已成為滇池TP 的主要來源[43-44].

3 結論

a) 通過在線固相萃取-UPLC-MS/MS 建立了8種MCs 的快速檢測方法，省去了繁雜的離線固相萃取程序，該方法測試時間短(11 min)、靈敏度高、重現性強，為監管部門提供了技術思路.

b) 滇池MCs 污染程度得到了較大幅度削減，整體上處于較低水平，但是在春夏季的局部區域污染嚴重，可能存在較高的生態風險.

c) 滇池MCs 具有明顯的時間和空間變化規律，時間上呈現夏季最高、春季次之、秋季和冬季較低的趨勢；空間上，在秋冬季呈現出南北低、中部高的分布特征，春夏季重污染的區域集中在滇池中部和北部. 建議開展更長周期的連續監測研究，掌握MCs 在滇池水體中的分布規律，為有效控制MCs 和凈化水環境奠定基礎.

d) 對滇池MCs 總量貢獻最高的是MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR，MC-LR 和MC-LW 的占比隨季節有較大波動，其他MCs 的占比則相對穩定.

e) 滇池MCs 與藻細胞密度呈顯著負相關，與Chla 濃度呈極顯著正相關，可能是由于滇池特殊的地面流場和水流特性造成的. 相關性分析表明，光照強度(透明度)和營養鹽(氮、磷、有機物)是控制滇池MCs 產生的重要因子. 建議進一步摸清滇池MCs在風力、流場作用下的遷移機制，為MCs 溯源和生態風險防控提供依據.