生活污水中苯二氮?類藥物及其新型策劃藥分析方法優化及應用

朱 珠，張苓榮，趙孟林，張 璇，郝芳華，李喜青，杜 鵬

1. 北京師范大學水科學研究院，城市水循環與海綿城市技術北京市重點實驗室，北京 100875

2. 北京大學城市與環境學院，地表過程分析與模擬教育部重點實驗室，北京 100871

苯二氮?類藥物(benzodiazepines，BZDs)作為精神科門診普遍使用的強效鎮靜安眠藥物，連續使用易形成藥物依賴，在全球范圍內已出現普遍的濫用現象[1-2]. 新型苯二氮?類策劃藥(designer benzodiazepines，DBZDs)則多為常用BZDs 的結構修飾物，藥效與BZDs相似，但在國內未通過藥物監管部門的上市批準. 因缺少法律監管，DBZDs 已成為毒品市場盛行的一類新精神活性物質[3-4]. 同時，BZDs 和DBZDs 會通過服用者排泄物經市政管網匯入污水處理廠，因生活污水中檢出BZDs 和DBZDs 的報道逐年增多，有關部門已將依替唑侖等BZDs 和DBZDs 作為重點監管對象[5].此外，污水處理廠未能去除的BZDs 和DBZDs 原藥或代謝產物隨出水排入地表水環境，因其仍具有較高的生物活性，給水生生物[6-7]和居民飲用水[8-9]安全帶來了潛在威脅. 針對BZDs 和DBZDs 使用造成的社會問題和環境問題，對此類藥物的使用情況進行實時監測，并估算其使用量，對禁毒部門制定管控政策和新型污染物健康風險評價具有重要意義[10-11].

環境分析科學技術的發展催生了基于污水流行病學(wastewater-based epidemiology，WBE)的毒品濫用監測手段，該方法通過對生活污水中目標化合物濃度水平的分析，獲取接近實時的區域毒品濫用水平、時空分布等關鍵信息[12-15]，較傳統藥物濫用調查方法更客觀高效. 歐洲[16-17]、亞洲[18]、美洲[19]等地區已廣泛應用WBE 方法監測其傳統和新型毒品的濫用水平. 隨著社會對公共健康關注度的不斷提高，WBE 的研究對象逐漸轉向了與人體健康相關的生物標志物，如煙草、酒精[20]、咖啡因[21]等合法成癮性物質，具有強效鎮痛效果的曲馬多、阿片類藥物[22]，治療細菌疾病的抗生素[23]以及與糖尿病高血壓等常見基礎病有關的二甲雙胍[24]、美托洛爾[25]等，以進一步挖掘污水中所包含的人類生活方式及健康狀況信息. 此外，在新型冠狀病毒全球大流行的背景下，以病原體為生物標志物，污水流行病學在傳染病預警、疾病傳播動態監測以及社區感染人數預測等方面的作用和價值同樣被不斷發掘[26-27]. 然而，針對治療失眠、焦慮的BZDs 和新精神活性物質DBZDs 的WBE 研究仍然較為匱乏. Baker 等[28]利用高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術建立了污水中65 種非法藥物及處方藥的分析方法，其中包含地西泮、硝西泮等7 種常用BZDs 處方藥，并對英國城市污水中BZDs 進行了檢測，發現該類藥物濃度在11.9~209 ng/L 之間；Yuan等[29]報道了國內阿普唑侖、勞拉西泮及奧沙西泮在北京醫療廢水和生活污水中的賦存情況，Wu 等[8]對黃浦江及沿江污水廠中地西泮、阿普唑侖、艾司唑侖等8 種BZDs 處方藥進行監測，結果表明該類藥物在北京、上海各類水體中廣泛存在. 由于BZDs 藥物種類繁多，現有報道中所包含的BZDs 種類較少，且多為地西泮、奧沙西泮等常用藥物，缺乏針對尼美西泮、三唑侖等BZDs 類第三代毒品以及吡唑侖、依替唑侖等非法DBZDs 的相關研究. 因此，建立一種涵蓋較全種類BZDs 和DBZDs 的高靈敏度、高選擇性污水分析方法，可對BZDs 和DBZDs 的使用情況進行更為系統全面的監測.

該研究以25 種BZDs 和DBZDs 為研究對象，利用固相萃取(SPE)前處理技術和LC-MS/MS 實現對污水樣品中目標化合物的分析測定，并對分析方法進行了優化. 通過回收率、基質效應、檢出限和定量限、精密度等質量控制指標對分析方法進行評價. 通過對北京市主城區6 家污水廠進水樣品的分析驗證了優化后方法的可靠性，以期為BZDs 和DBZDs 的精確監管、來源追溯提供可靠的技術手段，也為進一步開展該類藥物的污水流行病學研究提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

該試驗所用標準樣品具體包括：常用BZDs 處方藥及其代謝產物阿普唑侖(ALP)、α-羥基阿普唑侖(OHALP)、氯硝西泮(CZP)、7-氨基氯硝西泮(7ACZP)、地西泮(DZP)、去甲地西泮(NDZP)、替馬西泮(TZP)、奧沙西泮(OZP)、艾司唑侖(EZM)、勞拉西泮(LZP)、咪達唑侖(MZM)、硝西泮(NZP)、氯甲西泮(LMZP)；BZDs 類第三代毒品氟硝西泮(FNZP)、尼美西泮(NMZP)及其代謝產物7-氨基尼美西泮(7ANMZP)、三唑侖(TZM)；非法DBZDs 標準樣品氯地西泮(CDZP)、地洛西泮(DLZP)、氟丙西泮(FBZP)、甲氯硝西泮(MCZP)、吡唑侖(PZM)、依替唑侖(ETM)；非苯二氮?類新型安眠藥富馬酸喹硫平(QTP)和唑吡坦(ZPM)(均為濃度100 μg/mL 的甲醇溶液，純度>99%). 9 種氘代內標ALP-D5、 OHALP-D5、 DZP-D5、 NDZP-D5、 OZP-D5、EZM-D5、 LZP-D4、 ETM-D3和ZPM-D6(均 為 濃 度10 μg/mL 的甲醇溶液，純度>99%)，以上標準樣品均購自美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇(LC-MS 級)和乙腈(LC-MS 級)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸、甲酸銨、氨水均購自上海安譜試驗科技股份有限公司，均為HPLC 級；超純水由MilliQ 系統(德國Merck KGaA 公司)制備；Cleanert PEP 和Cleanert PCX(60 mg，3 mL)固相萃取柱購自天津博納艾杰爾科技有限公司；針式過濾器(1.0 μm，玻璃纖維)購自天津市科藝隆試驗設備公司；離心過濾管(0.2 μm)購自美國Costar 公司.

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(Triple QuadTM6500+)購于美國AB SCIEX 公司；固相萃取裝置(SBEQCG1416)、氮吹儀(EFAA-DF24)購于上海安譜實驗科技股份有限公司；渦旋振蕩器(VXMNDG)購于奧豪斯儀器(常州)有限公司；離心機(MiniMax17)購于湖南可成儀器設備有限公司；KQ3200B 型超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司.

1.3 LC-MS/MS 條件優化

根據目標化合物的性質選擇離子源和離子化模式. 將濃度為20 ng/mL 的目標化合物標準溶液通過針泵恒流的進樣方式注入質譜，選取2 個豐度強且穩定的子離子分別作為定量離子和定性離子. 采用多反應監測(MRM)模式優化各特征離子的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)，最終根據各目標化合物的保留時間設置分段采集模式以實現最大的響應強度. 采用安捷倫InfinityLad Poroshell HPH C18 液相色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，通過優化流動相pH、添加劑、洗脫梯度等條件，實現對目標化合物的有效分離并縮短分析周期.

1.4 樣品前處理方法

該研究采用固相萃取法(SPE)對樣品進行濃縮和凈化，固相萃取柱使用前依次向管內加入3 mL 甲醇、3 mL 超純水和3 mL pH=2 的超純水進行活化.取50 mL 經1 μm 濾膜過濾后的污水樣品，添加100 μL濃度為50 ng/mL 的內標混合溶液，靜置5~10 min 使其與樣品混合均勻. 調節固相萃取裝置使樣品以1 mL/min 的速度均勻加載，污水加載完成后依次使用2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗. 待萃取柱填料干燥后使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脫，洗脫液收集在10 mL 玻璃試管內，使用緩和氮氣在恒溫條件下緩慢將洗脫液吹至干燥. 向試管中加入500 μL 50%甲醇水溶液復溶管底殘留物，振蕩至洗脫物完全溶解，此時各污水樣品內標濃度均為10 ng/mL. 復溶液經0.2 μm 離心過濾管過濾后裝入專用樣品瓶，4 ℃下保存等待LC-MS/MS 分析測定.

1.5 質量控制

1.5.1 回收率

分別取25、125 和250 μL 濃度為20 ng/mL 混合標準溶液加入到50 mL pH=2 的超純水中配成不同濃度梯度的溶液，每組設置3 個平行樣品，并設置一組流程空白. 按1.4 節樣品前處理方法處理加標樣品并上機測定，根據流程空白、加標樣品的測定數據以及實際加標濃度計算得到經固相萃取后不同濃度25種目標化合物的回收率.

1.5.2 基質效應

該試驗選取北京肖家河污水處理廠的進水作為基質效應供試水樣，按1.4 節對供試水樣進行樣品前處理，使用前處理后的供試水樣配制體積為500 μL、濃度范圍為1~10 ng/mL 的加標水樣. 經LC-MS/MS分析測定得到各目標物質在污水樣品和不同濃度的加標污水樣品、標準樣品中的響應峰面積，比較加標前后目標物質響應的變化，評價基質對分析儀器響應信號的抑制或增強效應，計算公式[30]：

式中：ME 表示基質效應，%；Aaddition表示經LC-MS/MS分析測定得到的各目標物質響應峰面積；Ablank為污水中目標物質的峰面積；Astandard為目標物質標準樣品峰面積.

1.5.3 檢出限和定量限

將系列低濃度混合標準溶液(0.01~0.1 ng/mL)上機測定，以信噪比S/N 為3 時對應的濃度為儀器檢出限(ILOD，ng/L)，S/N 為10 時對應的濃度為儀器定量限(ILOQ，ng/L). 方法檢出限(MLOD，ng/L)和定量限(MLOQ，ng/L)分別通過式(2)(3)計算：

式中：V1為上機濃縮液的體積，取值為500 μL；V2為前處理所取污水樣品的體積，取值為50 mL.

1.5.4 標準曲線的線性及范圍

該試驗對環境樣品中目標物質的濃度范圍進行估計，在估計濃度上限的2~3 倍內配制含甲醇體積50%、濃度梯度范圍為0.01~10 ng/mL 的系列標準溶液. 上機測定后擬合標準曲線，相關系數(R2)應不低于0.99，同時滿足范圍內的標準樣品分析定量準確度在80%~120%之間.

1.5.5 精密度

采用對同一標準樣品連續多次測定結果(n=4)和多天重復測定結果(n=4)的相對標準偏差(RSD)來評價儀器的日內精密度與日間精密度，15%的RSD作為方法可接受的標準上限.

1.6 使用量估算

利用污水處理廠日均流量、服務區域常住人口數據等可估算出地區目標物質的人均負荷水平，進而反向推算出藥物使用量，其計算公式：

式中：L為藥物千人均負荷量，mg/(1 000 inh·d)，其中inh 表示inhabitant；Cin為污水處理廠進水樣品濃度，ng/L；Fin為污水處理廠的平均進水流量，m3/d；P為污水處理廠服務人口數；U為北京市各BZDs 的使用量，mg/(1 000 inh·d)；E表示目標物質生物標志物的人體排泄率，%；MWratio表示目標物質母體與其生物標志物的摩爾質量比值.

2 結果與討論

2.1 優化后的LC-MS/MS 條件

25 種目標化合物分子結構中均含氮原子，且多呈仲胺或叔胺形式，在ESI 離子化模式下易與氫離子結合形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此該研究選擇在正離子檢測模式下，采用MRM 模式對所有目標化合物進行檢測. 離子源電壓(IS)為4 500 V，離子源溫度(TEM)為450 ℃，氣簾氣(CUR)壓力為25 psi，干燥氣(GS1)壓力為65 psi，輔助氣(GS2)壓力為55 psi，碰撞池氣壓(CAD)為6 psi. 各目標化合物及其相應內標質譜參數見表1.

表1 質譜檢測條件Table 1 Experimental conditions for mass spectrometry analysis

BZDs 在酸性條件下易于質子化，因此該研究選用10 mmol/L 甲酸銨(含0.1%甲酸)水溶液(流動相A)/乙腈(流動相B)作為流動相體系，以提高目標化合物的離子化率. 由于多數BZDs 結構和性質相似，其在色譜柱上的保留時間較為接近，故采用梯度洗脫方式提高其分離效果. 同時，7ACZP、7ANMZP 和ZPM的極性較強，因此設置較低比例的有機相作為初始流動相條件，以獲得較為理想的保留時間. 優化后的洗脫梯度：0~0.5 min，10% B 相；0.5~5 min，10%~90% B 相；保持90% B 相0.4 min；5.4~5.8 min，10%~90% B 相；保持10% B 相2.2 min. 色譜柱溫度為40 ℃，流速0.4 mL/min，進樣體積為2 μL. 圖1 為優化后25 種目標化合物的色譜圖，該方法能夠在5.4 min 內實現對所有物質的有效分離，顯著縮短了分析周期，同時提高了儀器對目標化合物的靈敏度.

圖1 目標化合物高效液相色譜圖Fig.1 Ultra-performance liquid chromatography chromatograms of all target compounds

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

該研究選擇SPE 技術對樣品進行凈化與富集，并比較Cleanert PCX 和Cleanert PEP 固相萃取柱(分別簡稱“PEP 柱”和“PCX 柱”)對25 種目標化合物的凈化回收效果，2 種柱子均按照1.4 節方法對污水樣品進行前處理，具體回收率如圖2 所示. 兩種萃取柱均采用聚苯乙烯/二乙烯苯為填料，PEP 柱表面同時具有親水性和憎水性基團，對各類極性、非極性物質具有較為均衡的吸附作用；PCX 柱則兼有陽離子交換和反相吸附混合作用力. 試驗結果表明，PEP 柱無法實現對OHALP 的吸附，對FNZP、MCZP、MZM、7ANMZP 等物質的回收率低于60%，對OZP、PZM、LMZP、NMZP 等物質的回收率則超過了200%；PCX柱對25 種目標物質均有較好的吸附和凈化效果，因此該研究選用PCX 柱進行SPE 前處理.

圖2 不同SPE 柱待測目標化合物回收率比較Fig.2 Comparison of recoveries using different SPE columns

2.2.2 淋洗條件的優化

PCX 柱在前處理過程中會吸附污水基質中的部分干擾組分，因此需要加入淋洗步驟降低基質組分對準確定量的影響. BZDs 多為中等或弱極性化合物，易溶于甲醇、乙腈等試劑，不易溶于水. 該研究在污水樣品加載完成后設置4 mL 純水、4 mL 2%甲酸甲醇溶液和2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇3 種淋洗條件并比較其凈化效果. 如圖3 所示，使用4 mL 純水淋洗時多數目標化合物的損失較少，但對非極性干擾組分凈化效果不佳；使用4 mL 2%甲酸甲醇溶液淋洗時對基質中干擾組分去除效果較好，但導致FNZP、MCZP、NZP 等物質損失較多，回收率低于80%；使用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇淋洗時，25 種目標化合物回收率均在80%~120%之間，凈化效果較為理想. 導致這一結果的原因為甲酸水能夠促進目標化合物質子化，使得萃取小柱對藥物的保留作用更穩定，而甲醇能有效去除干擾性基質，因此該研究選用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇作為前處理的淋洗溶液.

圖3 不同淋洗條件下待測目標化合物的回收率比較Fig.3 Comparison of recoveries using different flushing conditions

2.2.3 洗脫和復溶條件的優化

BZDs 經樣品加載后以質子化形式吸附于萃取柱，因其多為弱堿性化合物，在堿性條件下更易被洗脫溶液提取. 該研究選擇在甲醇中加入適量氨水來增加洗脫溶液的pH，以提高目標化合物的洗脫效率. 結果表明，連續分批加入體積為1 mL 的洗脫溶液時，初始流出液中多數物質洗脫率高于40%，隨著洗脫液體積的增加，在第4、第5 批次洗脫流出液中多數目標化合物洗脫率低于1%，因此該研究選擇4 mL 5%甲醇氨溶液作為洗脫液. 對于復溶過程，該研究分別考察了30%、50%、80% 3 種不同體積分數甲醇水溶液的復溶效果. 結果顯示，在30%甲醇水溶液復溶條件下CDZP、MZM、QTP 等物質未能實現較好的回收效果，而甲醇體積分數為80%時將削弱2.3.2 節淋洗步驟對萃取柱的凈化功效，使用50%甲醇水溶液復溶則能夠保證目標藥物的充分復溶和凈化效果，因此該研究選用50%甲醇水溶液作為復溶溶液(見圖4).

圖4 不同復溶條件下待測目標化合物的回收率比較Fig.4 Comparison of recoveries using different re-solvents

2.3 已優化方法的評價

2.3.1 回收率和基質效應

如表2 所示，經PCX 柱固相萃取后，25 種目標化合物在不同濃度梯度下的回收率均在80%~120%之間，基質效應(ME)在——20%~20%之間，滿足檢測要求.

表2 優化方法后目標化合物的回收率和基質效應Table 2 Recoveries and matrix effects of all target compounds using optimization method

2.3.2 檢出限、定量限、標準曲線線性、儀器準確度及精密度

如表3 所示，25 種目標化合物的方法檢出限和方法定量限在0.02~3.7 ng/L 之間，標準曲線在10~10 000 ng/L范圍內線性表現良好(R2>0.99)，不同濃度標準樣品定量準確度在80%~120%之間. 此外，儀器日內和日間精密度RSD(n=4)在1%~13%之間，均小于15%，儀器穩定性可達到試驗要求. 因此，該研究所采用的分析方法能夠滿足多種BZDs 和DBZDs 的同步定量分析.

表3 優化方法后目標化合物的檢出限、定量限、線性范圍及精確度Table 3 MLOD, MLOQ, linearity and precision of all target compounds using optimization method

2.4 分析方法在實際污水樣品中的應用

該研究于2020 年12 月——2021 年1 月對北京市6 家市政污水處理廠(WWTP-1~WWTP-6)的進水進行采樣(24 h 混合水樣)，生活污水比例均高于90%，具體運行數據見表4. 采用上述優化方法對樣品進行前處理和分析測定.

表4 北京市6 家污水處理廠的基本情況Table 4 Basic information on the six WWTPs in Beijing

檢測結果顯示，進水樣品中18 種目標化合物被檢出. ALP、DZP、NDZP、OZP、EZM、NMZP、MZM、QTP、ZPM 檢出率為100%，TZP 檢出率高于90%，表明BZDs 在北京地區被廣泛使用. 其中OZP 在6 個污水廠進水中平均檢出濃度最高，范圍為(15.1±1.4)~(22.4±3.8) ng/L，其 次 為QTP〔(10.1±1.4)~(18.5±1.5)ng/L〕 、 NMZP〔 (7.5±1.9)~(16.8±1.8) ng/L〕 、 DZP〔(2.9±0.2)~(7.1±2.0) ng/L〕、EZM〔(2.6±0.8)~(4.9±0.7)ng/L〕和LZP〔(3.1±3.9)~(8.8±7.4) ng/L〕，其余目標化合物濃度均小于4 ng/L(見表5). 值得注意的是，18 種檢出物質中有4 種屬于DBZDs(見表5)，分別為CDZP、ETM、FBZP 和MCZP，其濃度范圍為(0.03±0.1) ng/L(ETM) ~ (0.3±0.7) ng/L (MCZP). 在我國，DBZDs 未得到藥物監管部門的生產使用許可，無法通過合法途徑獲取. 此外，由于以上4 種DBZDs 結構或取代基團的特殊性，無法通過合法BZDs 代謝或降解生成. 因此，采樣污水處理廠服務區內可能存在DBZDs 濫用現象，應加強對此類藥物的檢測與管控.

表5 目標BZDs 和DBZDs 在北京污水處理廠進水中的平均濃度Table 5 Concentrations of target BZDs and DBZDs in influences of Beijing wastewater treatment plants

以藥物母體或代謝產物作為生物標志物，利用1.6 節式(3)(4)估算北京地區檢出率較高的幾種常用BZDs 的使用量. 結果顯示，QTP〔(401.8±198.7) mg/(1 000 inh·d)〕、NMZP〔(301.1±177.0) mg/(1 000 inh·d)〕、MZM〔(68.0±32.6) mg/(1 000 inh·d)〕 、 ZPM〔 (36.0±14.9)mg/(1 000 inh·d)〕及EZM〔(24.7±9.1) mg/(1 000 inh·d)〕的使用量遠高于OZP〔(7.4±2.5) mg/(1 000 inh·d)〕、ALP〔(4.0±4.9) mg/(1 000 inh·d)〕和DZP〔(3.5±1.5)mg/(1 000 inh·d)〕. 該研究結果低于2014 年Wang 等[31]對北京地區DZP 使用量的估算值〔(7.6~10.6) mg/(1 000 inh·d)〕，這可能與藥物生物標志物的選擇、居民用藥習慣的改變等因素有關.

3 結論

a) 該研究對污水樣品前處理方法和儀器條件進行了優化，結果表明前處理過程應選用Cleanert PCX萃取柱，依次使用2 mL 2%甲酸水溶液、2 mL 甲醇淋洗填料，使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脫目標化合物，氮吹后用500 μL 50%甲醇水溶液復溶殘留物.

b) 該試驗方法驗證結果表明，25 種目標化合物在回收率、基質效應、檢出限與定量限、線性范圍等方面符合試驗要求，該方法能夠實現超痕量目標化合物的準確、高效檢測.

c) 對北京市6 家污水處理廠進水樣品的測定說明該方法能夠滿足實際樣品的分析測定要求. BZDs在北京市生活污水中廣泛存在，雖然DBZDs 檢出率較低，但可能存在濫用現象，需加強對此類藥物的監測.

d) 由于未考慮BZDs 在污水管網中的穩定性，因此該研究對北京地區BZDs 使用量估算存在一定不確定性. 未來可開展BZDs 穩定性相關研究，從方法學上提高其估算結果的準確性.