不同種類冷凍保護劑對海帶配子體及孢子的毒性評價

錢瑞 陳書秀 羅世菊 趙聚萍 李曉捷

摘?要：為篩選用于海帶超低溫保存的冷凍保護劑，采用10%二甲基亞砜（DMSO）、10%甘油、10%蔗糖、10%乙二醇、10% DMSO+10%甘油、10% DMSO+8%葡萄糖、10% DMSO+10%蔗糖、10% DMSO+10%甘油+8%葡萄糖、10% DMSO+10%山梨醇等9種單一或復合冷凍保護劑，在0～4 ℃條件下分別對海帶配子體和孢子進行處理，對配子體處理30 min、60 min、24 h，對孢子處理15、30、60 min，通過統計配子體細胞的存活率以及孢子萌發成配子體的比例，對不同種類的冷凍保護劑進行毒性評價。結果表明：9種冷凍保護劑均對海帶配子體和孢子有一定的毒性作用，并且毒性隨著處理時間的延長而增強。10% DMSO對海帶配子體細胞的毒性最小，處理60 min后配子體細胞的存活率為100%；其次是10%乙二醇，處理30 min后配子體的存活率為100%；含10%甘油的單一或復合冷凍保護劑對配子體細胞毒性較大，處理后配子體的成活率顯著低于DMSO和乙二醇組（P＜0.05）。單一冷凍保護劑對海帶孢子的毒性顯著低于復合冷凍保護劑，除10%甘油組處理30、60 min外，其他單一冷凍保護劑試驗組的配子體發生率均在60%～80%。

關鍵詞：海帶；配子體；孢子；冷凍保護劑；毒性

保護和利用好海帶種質資源可為提高海帶品種水平、實現海帶良種化生產提供重要保證。20世紀70年代末，我國研究人員發現，在人工培養條件下，雌、雄配子體能形成無性繁殖系（克隆），并能產生配子，從而開始了海帶種質保存技術的研究［1-4］。在海帶配子體世代，將單個配子體分離，使其在適宜的培養條件下進行無性繁殖，以無性繁殖系的形式進行海帶配子體的繼代培養保存。此法基本實現了海帶種質的長期保存，但也存在明顯不足：采用液體培養保存一般需要在半個月內更新1次培養液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質污染及混雜的概率；在采孢子前無法對種海帶進行無菌處理，不能杜絕微生物尤其雜藻的污染；培養過程中細胞形態異常、單性生殖等現象時有發生［5-7］。因此，該保種技術還不能做到種質永久保存，無法完全排除混雜、污染、變異的可能性［8］。大量研究表明，生物細胞、組織、器官、胚胎甚至個體在超低溫（-196 ℃）狀態下代謝完全停止，生命可以在這種靜止的狀態下被長期保存，解凍后又可恢復其原有的生物活性和遺傳特性［9］。超低溫保存技術既避免了在傳統的動、植物組織和細胞培養過程中可能發生的染色體、基因組和基因水平上的變異，又保存了細胞的活力和形態發生的潛能［10-13］。水生動物、藻類和微生物的細胞超低溫保存技術是建立水生生物種質資源細胞庫、胚胎庫和基因庫的基本技術，將有效解決藻類種質保存中污染、混雜、變異等問題，從而實現藻類種質的永久保存。

海帶生活史包括肉眼可見的孢子體和顯微可見的配子體兩個世代，其中配子體世代包括游孢子、胚孢子和配子體3個階段。通常海帶種質保存是以絲狀體作為材料，但絲狀體是由人工分離的單個配子體培養而成，由于培養空間、操作方法等的限制，大數量株系的保存很困難，保存有限株系又難以滿足遺傳多樣性研究和應用。相反，孢子懸液含有大量的孢子，對其進行凍存可保存大量的株系［14］。因此，研究海帶配子體和孢子的超低溫冷凍技術有利于推動海帶種質保存技術的發展。冷凍保護劑的應用在超低溫保存技術發展中具有里程碑作用，使用毒性小、高效的冷凍保護劑是海帶種質超低溫冷凍保存成功的關鍵。

本研究以海帶配子體和孢子為試驗對象，采用單一或復合冷凍保護劑對其進行不同時長處理，通過統計海帶配子體細胞的存活率及海帶孢子萌發成配子體的比例，對不同種類的冷凍保護劑進行毒性評價，并篩選出毒性作用小且有效的冷凍保護劑，以期為海帶種質超低溫冷凍保存冷凍保護劑的選擇提供依據。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

試驗用海帶配子體為國家海藻與海參工程技術研究中心海藻種質庫保存的901海帶配子體克隆系，編號為019601018。海帶孢子從葉片表面長有孢子囊的成熟海帶（901）中采集獲得。

1.2?冷凍保護劑種類及配比

試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。以煮沸冷卻的海水為基礎液，按表1中的成分和比例配制9種單一或復合冷凍保護劑。配制好的冷凍保護劑存放在0～4 ℃冰箱中備用。

1.3?配子體克隆系預處理

取適量配子體（編號019601018）克隆團，用智能型超聲波細胞粉碎儀（型號JYD-650，上海之信儀器有限公司）進行細胞粉碎。粉碎機實際功率為250～300 W，超聲時長6 s，超聲次數4次，每次間隔時間5 s。粉碎的細胞液用孔徑38 μm的篩絹過濾至消毒的培養皿中。培養皿放置在低溫弱光［4～8 ℃、1～2 μmol/（m2·s）］條件下靜置培養1周，備用。

1.4?海帶孢子的獲得

選取成熟度好的種海帶，剪下長有孢子囊的小塊，經沖洗、擦拭、消毒處理，加低溫海水，大量放散游孢子后，將經孔徑38 μm篩絹過濾的游孢子液倒入各培養皿中，使孢子附著于培養皿底部。

1.5?冷凍保護劑對海帶配子體的毒性影響

1.3中所述預處理的配子體細胞經1周靜置培養后得以恢復，且附著于培養皿底部。將培養皿中的培養液倒掉，加入事先預冷的各組冷凍保護劑，作為試驗組；以未添加冷凍保護劑的海水培養組作為對照組；每組均設3個平行。所有處理組均在0～4 ℃條件下分別處理30 min、60 min、24 h，結束后更換普通海水培養液，然后統計細胞的存活率。每組計數200個細胞，統計存活細胞數占總細胞數的百分比。

1.6?冷凍保護劑對海帶孢子的毒性影響

當1.4中所述的培養皿底部附著的孢子達到一定密度時，倒凈孢子液，重新加入事先預冷的低溫冷凍保護液，在0～4 ℃條件下分別處理15、30、60 min。處理結束后，在保證孢子體附著的前提下，用海水培養液沖洗10次以上，以最大程度減少冷凍保護劑的殘留。所有處理組均添加普通海水培養液，放置在溫度8～10 ℃、光強22～24 μmol/（m2·s）、光周期12（L）：12（D）（即光照時間和黑暗時間各為12 h）條件下培養，88 h后統計配子體發生率（即胚孢子體萌發成配子體的比例）。配子體發生率即細胞內含物集中于萌發管頂端的細胞數量占總細胞數的百分比。每個處理組計數細胞200個。

1.7?統計分析

采用雙因子方差分析檢驗不同保護劑和處理時長對配子體存活率和孢子的配子體發生率的影響，采用相同冷凍保護劑、在相同處理時長下進行單因子方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncans方法進行差異顯著性分析。用Levens-test進行方差齊性檢驗，必要時進行數據轉化。設P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。所有統計分析均采用SPSS 19.0軟件完成。

2?結果

2.1?冷凍保護劑對海帶配子體的毒性評價

冷凍保護劑的類型、處理時長及兩者的交互作用均對配子體成活率有顯著的影響（見表2）。冷凍保護劑種類的偏Eta2值（0.980）>處理時長的偏Eta2值（0.855）>保護劑種類×處理時長的偏Eta2值（0.578），表明這3個因素對海帶配子體存活率的影響效應為：保護劑種類>處理時長>兩者的交互作用。

不同冷凍保護劑及不同處理時長下配子體的成活率見表3。從表3可以看出，除10%乙二醇和10%甘油外，用其他冷凍保護劑處理24 h后，配子體的成活率顯著低于處理30、60 min的（P＜0.05）。10%甘油組處理24 h的成活率也顯著低于處理30 min的（P＜0.05）。用10%乙二醇和10% DMSO處理30 min以及用10% DMSO處理60 min，配子體的存活率均為100%。在相同處理時長下，含有10%甘油的單一或復合冷凍保護劑對配子體細胞的毒性作用較大，配子體細胞的成活率均低于45%，顯著低于其他單一冷凍保護劑組（P＜0.05）。

2.2?冷凍保護劑對海帶孢子的毒性評價

冷凍保護劑的類型、處理時長及兩者的交互作用均對孢子萌發配子體的形成率有顯著的影響（見表4）。冷凍保護劑種類的偏Eta2值（0.979）>處理時長的偏Eta2值（0.891）>保護劑種類×處理時長偏Eta2值（0.787），表明這3個因素對孢子萌發配子體的影響效應為：保護劑種類>處理時長>兩者的交互作用。孢子經不同冷凍保護劑處理不同時間后，在溫度8～10 ℃、光強22～24 μmol/（m2·s）的條件下培養88 h，其配子體發生率的統計結果見表5。

從表5可以看出，除10% DMSO、10%乙二醇和 10%DMSO+10%甘油+8%葡萄糖組外，其他冷凍保護劑組處理60 min后，配子體發生率顯著低于15 min和30 min時，前兩種在30、60 min間差異不顯著。10%甘油處理15 min后，配子體發生率顯著高于處理30 min（P＜0.05），其他單一冷凍保護劑處理15 min和30 min時的配子體發生率差異不顯著（P＞0.05）。單一冷凍保護劑組配子體發生率顯著高于復合冷凍保護劑組，除10%甘油的30、60 min 2個試驗組外，其他單一冷凍保護劑試驗組的配子體發生率均在60%～80%。

3?討論

3.1?冷凍保護劑對海帶配子體的毒性評價

抗凍保護劑的應用在超低溫保存技術的發展中具有里程碑作用，能有效減少超低溫保存時冷凍對細胞造成的損傷。但多數保護劑對細胞有一定的毒性，毒性大小與使用濃度及處理時間有關［15-16］。在藻類種質冷凍保存中，最常用的保護劑是二甲基亞砜（DMSO）、甘油和甲醇，其中DMSO的使用最為普遍。Zhang等［17］研究發現，DMSO是對海帶配子體毒性最小的抗凍保護劑，它可以快速滲透到細胞質內發揮作用。本研究也得出了相似的結論。本試驗中采用的冷凍保護劑均對海帶配子體細胞有一定的毒性作用，隨著處理時間的延長，其毒性作用隨之增強，其中10%DMSO對配子體細胞毒性最小，處理60 min，配子體細胞的存活率為100%，處理24 h，配子體細胞的存活率在70%以上。

3.2?冷凍保護劑對海帶孢子的毒性評價

曲善村［14］研究了海帶游（胚）孢子超低溫保存技術，發現DMSO、甘油、蔗糖、葡萄糖及山梨醇對海帶孢子均有毒性，其中DMSO是對孢子毒性最小且對凍存最有效的抗凍保護劑，采用5% DMSO平衡50 min以內，10% DMSO或甘油平衡15 min以內，均可獲得70%以上的配子體發生率。本研究也得出了相似的結論。試驗中所使用的冷凍保護劑均對孢子有一定的毒害作用，不僅影響了孢子的配子體發生率，而且延緩了配子體發生。采用10% DMSO、10%蔗糖、10%乙二醇處理海帶孢子60 min以內，可獲得60%以上的配子體發生率。經復合保護劑處理的孢子萌發成配子體的百分比顯著低于單一保護劑，說明復合保護劑對海帶孢子的毒性高于單一抗凍保護劑。此結果與在某些微藻、紫菜、萱藻等的研究［18-23］中得出的結果有所差異。在這些藻類的超低溫保存中，使用復合保護劑比單一保護劑的效果好，復合保護劑可以減輕或消除單一保護劑成分對細胞產生的毒害作用，而且各種保護劑的作用可以相互協調，共同作用。

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Abstract： In order to screen the cryoprotectants of ultra-low temperature preservation of kelp，nine single or compound cryoprotectants including 10% Dimethyl sulfoxide（DMSO），10% glycerol，10% sucrose，10% ethylene glycol，10% DMSO+10% glycerol，10% DMSO+8% glucose，10% DMSO+10% sucrose，10% DMSO+10% glycerol+8% glucose，and 10% DMSO+10% sorbitol were used to treat the gametophytes and spores of kelp for 30?min，60 min，24 h and 15?min，30 min，60?min，respectively，at 0-4 ℃.The toxicity of different cryoprotectants was evaluated by calculating the survival rate of gametophyte cells and the proportion of spores germination.The results showed that all the 9 cryoprotectants had certain toxic effects on gametophytes and spores of S. japonica，and the toxicity increased with the extension of treatment time.The toxicity of 10% DMSO to gametophytic cells was minimal，and the survival rate of was 100% after 60 min treatment，followed by 10% ethylene glycol.The survival rate of gametophyte treated with single or compound cryoprotectant containing 10% glycerol was significantly lower than that of DMSO and ethylene glycol groups（P<0.05）.The toxicity of single cryoprotectant was significantly lower than that of compound cryoprotectant，the incidence of gametophyte treated with single cryoprotectant was 60%-80% except 10% glycerol group treated for 30 min，60?min.

Key words： Sacchatina japonica; gametophyte; spore; cryoprotectant; toxicity

作者簡介：錢瑞（1979—），女，工程師，研究方向為大型海藻種質資源保存及遺傳育種。E-mail：359148694@qq.com。

通信作者：陳書秀（1983—），女，高級工程師，研究方向為海藻種質資源保存及遺傳育種。E-mail：chenshuxiu124@163.com

項目資助：山東省重點研發計劃重大科技創新工程項目（2022LZGC004）;財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系 （CARS- 50）;山東省農業良種工程項目（2021LZGC004）;國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項（2018YFD0901500）;山東省現代?農業藻類產業技術體系（SDAIT-26）;煙臺市校地融合發展項目。