m6A修飾在乳腺癌侵襲轉移和化療耐藥中的研究進展

劉思涵 余和芬

1.首都醫科大學第八臨床醫學院，北京 100038；2.首都醫科大學生物化學與分子生物學系，北京 100069

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤，其發病率以每年0.5%的速度增長[1]。在女性群體中，乳腺癌已取代肺癌，成為發病率最高的腫瘤[2]。由于早期診斷的普及和治療手段的進步，乳腺癌的五年生存率已從20 世紀60 年代的63%上升為現在的90%。然而，對于確診時即為進展期或已經發生轉移的乳腺癌患者來說，五年生存率僅為26%。乳腺癌仍是危害女性健康的嚴重疾病。表觀遺傳學一直是生命科學領域的研究熱點，m6A 修飾作為真核細胞內最普遍的RNA 修飾形式，通過影響RNA 的多種生物學過程，參與腫瘤的發生發展和耐藥等多個方面。本文就m6A 修飾與乳腺癌侵襲轉移和化療耐藥的有關研究做一綜述，旨在從m6A 修飾表觀遺傳角度為延緩乳腺癌侵襲轉移，逆轉乳腺癌化療耐藥提供參考依據。

1 m6A修飾概述

1.1 m6A修飾的基本概念

m6A 修飾是發生在真核細胞RNA 中一種最主要的表觀遺傳修飾，其具體含義是指腺嘌呤（A）第6 位氮原子形成的一種甲基化修飾。m6A 修飾具有序列偏好性，主要定位于保守的RRACH 序列（R=G或A；H=A、C 或U）中，且此序列富集于mRNA 的3’非翻譯區（3’-UTR）和終止密碼子區[3]。

1.2 m6A修飾的動態調控

m6A 修飾是一種動態可逆的變化過程，主要由三種類型的蛋白調控，分別是m6A 甲基轉移酶（writers）、m6A 去甲基酶（erasers）以及m6A 識別蛋白（readers）。

1.2.1 m6A 甲基轉移酶 m6A 甲基轉移酶的主要功能是以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，在mRNA 的分子的特定位點加入m6A 修飾。目前明確的m6A 甲基轉移酶主要包括甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉移酶樣蛋白14（methyltransferaselike 14，METTL14）和腎母細胞瘤1- 相關蛋白（Wilm’s tumor 1-associated protein，WTAP）。METTL3 具有催化活性，將甲基轉移至受體腺嘌呤6 號氮原子。METTL14 本身不具備催化活性，但是可以穩定RNA 底物并促進METTL3 的催化活性。WTAP 通過與METTL3 和METTL14 相互作用 將其招募至相應的mRNA 靶點。其他m6A 甲基轉移酶還有RNA 結合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、鋅指CCCH 域蛋白13（zinc finger CCCH domain containing protein13，ZC3H13）、METTL16（methyltransferase-like16，METTL16）等。

1.2.2 m6A 去甲基酶 目前明確的m6A 去甲基酶主要有肥胖相關蛋白（fat-mass and obesityassociated protein，FTO） 和Alk B 同源物5（Alk B homolog 5，ALKBH5）。盡管FTO 和ALKBH5 都可以去除甲基，但是它們二者對底物的選擇性具有差異，FTO 可以去除m6A 修飾和m6Am 修飾中的甲基，而ALKBH5 只能去除m6A 修飾上的甲基。除此之外，FTO 和ALKBH5 在去甲基序列的偏好性和去甲基的具體過程也不完全相同。

1.2.3 m6A 識別蛋白 如果說甲基轉移酶和去甲基酶共同調節細胞內mRNA 的m6A 水平，那么m6A識別蛋白則通過選擇性結合m6A 甲基化修飾在下游發揮調控作用。m6A 識別蛋白主要包括YTH結構域蛋白1-2（YTHDC1-2）、YTH 結構域家族1-3（YTHDF1-3）、異質核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNPs）， 包 括HNRNPC、HNRNPG、HNRNPA2B1、真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）等。結合蛋白通過直接或間接與m6A 修飾位點結合，發揮調節mRNA 的功能。

2 m6A修飾與乳腺癌侵襲轉移

2.1 m6A甲基轉移酶與乳腺癌侵襲轉移

多種m6A 甲基轉移酶參與調控乳腺癌的侵襲轉移。METTL3 作為最重要的m6A 甲基轉移酶，其在乳腺癌侵襲轉移中發揮的作用還存在爭議。Hu等[4]發現METTL3 在乳腺癌中高表達并提示預后不良，通過在蛋白質水平調控Zeste 基因增強子同源物2（enhancer of Zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2），進而下調E-鈣黏蛋白（E-cadherin），促進乳腺癌細胞發生上皮間質轉化和遠處轉移。然而，Shi 等[5]發現，METTL3 在三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中低表達，并且與短距離無轉移生存密切相關。在此基礎上，Ruan 等[6]揭示了TNBC 中METTL3 的上游調控因子，提出miR-34c-3p 通過降低METTL3 mRNA 和蛋白質水平，促進TNBC 的增殖，轉移和侵襲。但是過表達circMETTL3 則可以通過分子海綿作用，阻止miR-34c-3p 和METTL3 mRNA 相互作用，逆轉miR-34c-3p 在TNBC 中的發揮的促癌作用。因此，circMETTL3 可能作為TNBC 治療的新方法。METTL3 在乳腺癌侵襲轉移中的作用機制十分復雜，目前還沒有達成共識，有待進一步的研究。

METTL14 作為m6A 甲基轉移酶復合物之一，也參與乳腺癌侵襲轉移的調控。Yi 等[7]發現，METTL14 在乳腺癌組織中高表達，通過調節m6A 修飾和hsa-miR-146a-5p 表達，進一步促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。而Gong 等[8]卻發現，METTL14在乳腺癌細胞中表達下調，導致結腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyposis coli，APC）基因的mRNA 穩定性降低。APC 作為Wnt 信號通路的拮抗劑，其水平降低可以導致Wnt 通路的異常激活，從而在腫瘤細胞的侵襲和轉移方面起到促進作用。研究表明[9-10]，METTL14 可以與多種長鏈非編碼RNA（lncRNAs） 相互作用，在腫瘤的侵襲轉移中發揮促進作用。異常的METTL4 和m6A 水平與乳腺癌病情和預后密切相關，有研究提出[11]，激素受體陰性的乳腺癌患者是否可能受益于外源性METTL14 的過度表達，為乳腺癌的臨床治療提供了新的分子靶點。

Wang 等[12]發現，WTAP 表達與乳腺癌腫瘤大小和分級呈正相關，與腋窩淋巴結轉移情況呈負相關，有關WTAP 抑制乳腺癌腋窩淋巴結轉移的潛在機制還有待進一步研究。Ou 等[13]首次提出WTAP可能作為C5aR1+中性粒細胞促癌通路中的重要中間因子，促進乳腺癌的進展。C5aR1+中性粒細胞通過分泌白細胞介素（interleukin，IL）-1β 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α，協同激活細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2），促進WTAP 磷酸化，增加其穩定性。增加的WTAP 通過促進烯醇化酶1（enolase 1，ENO1）m6A 修飾，誘導乳腺癌糖酵解，促進乳腺癌的惡性進展，創新性地提出了C5aR1+中性粒細胞和WTAP-ENO1 網絡作為乳腺癌治療靶點的潛力。

2.2 m6A去甲基酶與乳腺癌侵襲轉移

FTO 失調在乳腺癌中的作用機制尚不明確。Jeschke 等 發現FTO 在乳腺癌中低表達，通過提高m6A 水平，調控Wnt 信號通路，促進上皮間質轉化。除此之外，Jeschke 等[14]還提出了FTO 低表達的腫瘤細胞對Wnt 通路抑制劑具有更高的敏感性，FTO 低表達的乳腺癌患者更有可能從Wnt 抑制劑中獲益。然而，Xu 等[15]發現FTO 在人表皮生長因子受體-2（HER-2）陽性的乳腺癌中高表達，通過FTO/miR-181b-3p/ARL5B 軸，加速腫瘤細胞遷移和侵襲。作為除FTO 以外的另一種m6A 去甲基酶，ALKBH5 在乳腺癌中侵襲轉移中作用也逐漸被更多的學者關注。Zhang 等[16-17]發現，ALKBH5可能作為缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）的下游靶基因，和鋅指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）協同，降低NANOG 同源盒蛋白（NANOG homeobox，NANOG）和Kruppel 樣因子（Kruppel like factor，KLF）4 mRNA的m6A修飾水平，提高NANOG 和KLF4 的mRNA 穩定性，進而增加乳腺癌發生和轉移所需的干細胞的百分比，在乳腺癌中起到致癌作用。以上研究為臨床提供了研發ALKBH5 抑制劑阻止乳腺癌侵襲轉移的新思路。

2.3 m6A識別蛋白與乳腺癌侵襲轉移

YTHDF1 是用途最廣、功能最強的識別蛋白。研究表明[18-20]，YTHDF1 與包括消化系統，呼吸系統，泌尿系統在內的多種腫瘤的進展密切相關。YTHDF1 在乳腺癌組織和細胞中高表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、上皮間質轉化等惡性進展呈正相關，而與生存期和免疫細胞腫瘤浸潤呈負相關。關于YTHDF1 促癌作用的潛在機制，Sun 等[21]認為YTHDF1 可以通過METLL14 依賴的方式調控E2F 轉錄因子8（E2F transcription factor 8，E2F8）mRNA 的穩定性和DNA 損傷修復，發揮致癌作用。Chen 等[22]則認為乳腺癌中高表達的YTHDF1 可以通過識別并結合到叉頭盒蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）mRNA 的m6A 修飾位點，促進FOXM1的翻譯，發揮致癌作用。Yao 等[23]發現，腫瘤內缺氧可以誘導HIF-1α，抑制miR-16-5p 表達，進而促進YTHDF1 的表達，最后通過上調丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）增強腫瘤糖酵解，發揮促癌作用。除YTHDF1 以外，Lin 等[24]還發現，在TNBC 細胞中，YTHDF3 可以通過m6A 修飾依賴的方式增強E 盒結合鋅指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）mRNA 的穩定性，發揮促癌作用。通過以上研究，YTHDF1 和YTHDF3 有望成為乳腺癌患者預后評價指標和潛在的治療靶點。

Lv 等[25]將HNRNPC 與在多種腫瘤中表達異常的circRNA 聯系起來，推測乳腺癌中上調的circBACH2 在細胞質中作為has-miR-944 的分子海綿，促進HNRNPC 的表達和活性，進而影響MAPK 信號通路，從而加速BC 細胞的增殖。Shi 等[26]提出IGF2BP1 與長鏈非編碼RNA MIR210HG 相互作用，通過MYCN/IGF2BP1/MIR210HG/miR-210 軸，在乳腺癌進展中發揮促癌作用。

3 m6A修飾與乳腺癌化療耐藥

阿霉素是多種表型乳腺癌化學治療的首選方案。Li 等[27]發現METTL3 在阿霉素耐藥的乳腺癌細胞中高表達，通過調控人肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的表達，招募E2F1 并激活下游前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR）的表達，從而促進乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥。Huang 等[28]發現，WTAP 可以與lncRNA DLGAP1-AS1 形成正反饋環，促進乳腺癌細胞化療耐藥。Wang 等[29]發現在對阿霉素耐藥的乳腺癌細胞中FTO 高表達，并且其發揮作用與信號轉導蛋白和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）相關。STAT3 是促進乳腺癌細胞產生化療耐藥的重要因子，STAT3 和FTO 通過形成雙向促進的環路，促進乳腺癌細胞對阿霉素的化療耐藥。雖然文獻數量較少，但FTO 在化療耐藥乳腺癌細胞中的高表達水平這一觀點基本一致。在未來，是否可以利用FTO 抑制劑來逆轉乳腺癌化療耐藥有待進一步研究。Wu 等[30]發現蛋白精氨酸甲基轉移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）通過增強ALKBH5 的核轉位，從而上調ALKBH5，去除BRCA1 的m6A 修飾以穩定mRNA，進一步增強DNA 修復能力，從而降低阿霉素對乳腺癌細胞的療效。

4 總結與展望

m6A RNA 修飾除了在腫瘤的發生進展中起到重要調控作用，還與神經系統、生殖系統等多種疾病密切相關。參與m6A 修飾的有關蛋白通過與miRNA，lncRNA，circRNA 等多種分子和免疫細胞相互作用，在乳腺癌侵襲進展和化療耐藥中發揮作用。正是由于參與m6A 修飾的有關蛋白種類繁多且功能各異，所以為抗癌藥物的研發提供了數目眾多的潛力靶點，也為逆轉化療耐藥提供了新思路。未來的研究中，臨床需要就各種關鍵的修飾蛋白在不同表型乳腺癌細胞中表達水平的高低得出統一結論，為乳腺癌靶向藥物的開發奠定理論基礎，以期通過藥物的高度靶向作用降低副作用。