microRNA-124過表達對肺動脈高壓大鼠肺血管重構的影響

朱鍵?陳天天?劉智勇?鄭常龍

【摘要】 目的 研究過表達微RNA-124（miR-124）對肺動脈高壓大鼠肺血管重構的影響及初步探索其可能機制。方法 使用野百合堿（MCT）經腹腔注射建立大鼠肺動脈高壓模型，氣管內滴注腺相關病毒（AAV） 介導的miR-124進行干預，記錄大鼠心臟右室收縮壓（RVSP）、平均動脈壓和心率，實時熒光定量PCR法檢測大鼠肺組織中miR-124的表達，van Gieson染色觀察肺內小動脈的重構程度并計算血管外徑在25～50 μm以及51～100 μm的肺小動脈的中膜/外徑比值，蛋白免疫印跡法檢測肺組織中IL-6與 p-STAT3的蛋白水平。結果 miR-124在肺動脈高壓大鼠肺組織中呈低表達；過表達miR-124可導致肺動脈高壓大鼠RVSP下降，肺內小動脈中膜/外徑明顯降低，肺組織中IL-6和p-STAT3的表達下調。結論 AAV介導的miR-124過表達可明顯減輕肺動脈高壓的大鼠的RVSP以及肺血管重構，其機制可能與下調IL-6和p-STAT3的表達有關。

【關鍵詞】 微核糖核酸-124；肺血管重構；肺動脈高壓

Effect of overexpression of microRNA-124 on pulmonary vascular remodeling in rats with pulmonary arterial hypertension Zhu Jian△， Chen Tiantian， Liu Zhiyong， Zheng Changlong. △Department of Emergency， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zheng Changlong， E-mail： zhchl5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of overexpression of microRNA-124 （miR-124） on pulmonary vascular remodeling， and to unravel the potential mechanism in rats with pulmonary arterial hypertension （PAH）. Methods In the monocrotaline （MCT）-induced PAH rat models， intratracheal infusion of miR-124 carried by adeno-associated virus （AAV） was performed. The right ventricular systolic blood pressure （RVSP）， mean systolic arterial pressure and heart rate were recorded. The expression level of miR-124 in lung tissues of rats was detected by real-time quantitative PCR. The histological morphology of pulmonary arterioles was observed by van Gieson staining. The ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles with vessel diameters in 25-50 μm and 51-100 μm were calculated. The expression levels of IL-6 and p-STAT3 protein in lung tissues were detected by Western blot. Results The expression level of miR-124 was down-regulated in pulmonary tissues of rats with PAH. RVSP was significantly decreased， the ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles were significantly attenuated， and the expression levels of IL-6 and p-STAT3 proteins were significantly down-regulated by overexpression of miR-124. Conclusion AAV-mediated overexpression of miR-124 can significantly reduce RVSP and pulmonary vascular remodeling in rats with PAH， probably by down-regulating the expression levels of IL-6 and p-STAT3.

【Key words】 MicroRNA-124； Pulmonary vascular remodeling； Pulmonary arterial hypertension

肺動脈高壓（PAH）是一種由肺血管重構引起的逐漸加重、病死率較高、預后較差的心血管疾病［1］。PAH的一個重要特征是肺微血管床進行性減少、肺小動脈重構進行性增加，導致肺的血管阻力也進行性增加，氣血交換減少，缺氧進行性加重，最終導致肺動脈壓明顯升高和右心衰竭，嚴重者可致死亡［2］。目前，臨床上針對肺血管張力增加的藥物，如磷酸二酯酶抑制劑和內皮素受體拮抗劑，可以緩解部分PAH患者的臨床癥狀和改善血流動力學參數，但其作用靶點并不能逆轉肺血管重塑，療效有限，無法有效降低PAH患者的病死率［3］。因此，抑制或逆轉肺血管重構的治療策略可能是治療PAH的新方法。微RNA-124（miR-124）被發現在神經細胞中大量表達、在神經發育中具有重要作用［4］。既往研究結果表明，miR-124可抑制PAH患者的血管平滑肌細胞的增殖，并可降低肺血管成纖維細胞的增殖和遷移［5-6］。然而，通過腺相關病毒（AAV）介導miR-124持續過表達能否有效抑制外膜成纖維細胞和血管平滑肌細胞的異常增殖，從而進一步減輕肺血管重構、治療PAH呢？miR-124在PAH中的作用及其作用機制如何亦尚不明確。因此，本研究擬用miR-124過表達的方法干預野百合堿（MCT）誘導的PAH大鼠模型，觀察其對PAH大鼠肺血管重構的變化，并初步探索其可能的分子機制，為臨床治療PAH提供動物實驗理論基礎。

材料與方法

一、實驗動物和試劑

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠32只，無特定病原體（SPF）級，體重180～200 g，購自中山大學動物實驗中心，由該中心SPF級動物房負責飼養，自由飲水、進食。本研究經中山大學實驗動物倫理委員會批準（批件號：IACUC-DB-16-1113），動物實驗操作均按國家相關實驗動物保護標準和動物使用指南進行。

MCT購自美國Sigma公司。磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3（p-STAT3）、STAT3及GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，IL-6抗體購自英國Abcam公司。AAV-U6-ZsGreen購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

二、實驗方法

1. 實驗分組與大鼠PAH模型的建立

32只大鼠按照隨機數字表法分為正常對照（control）組、MCT+生理鹽水（MCT）組、MCT+

AAV-綠色熒光蛋白（MCT+AAV-GFP）組和MCT+

miR-124（MCT+AAV-miR-124）組，每組8只。MCT+

NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，采用自制氣管導管套管插管，分別抽取100 μL生理鹽水、AAV-GFP（滴度為2.0×1015 vg/L）和AAV-miR-124（滴度分別為1.4×1015 vg/L）通過微量注射器緩慢滴入氣管 （vg為病毒基因組）。1 d后，MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124經腹腔注射MCT（60 mg/kg）制作大鼠PAH模型。

2. 大鼠血流動力學和右心室肥厚指數的監測

MCT給藥后35 d（實驗終點），經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠后，分離右側頸內靜脈，置入PE-100聚乙烯導管，連接換能器測量右心室收縮壓（RVSP）以反映肺動脈收縮壓。隨后分離出右側頸動脈，置入PE-50聚乙烯導管測量平均收縮動脈壓（mSAP）和心率（HR）。血流動力學檢測后處死大鼠，分離并取出大鼠心臟和肺，4 ℃磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，將左右心房剪去，分別分離出右心室（RV）、左心室及室間隔（LV+S）進行稱重（本部分操作由不清楚實驗分組的實驗員完成以避免主觀性偏倚），計算右心室與左心室加上室間隔之和的比值即為右心室肥厚指數（RVHI），RVHI=RV/（LV+S）。

3. 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測肺組織中miR-124的表達

將約100 mg大鼠右肺組織剪碎加入1 mL含RNA降解酶的TRIzol液中，研磨裂解，隨后加入氯仿提取肺組織總RNA，經純化后用紫外分光光度法測定RNA濃度及純度。使用RT-qPCR試劑盒進行逆轉錄反應，引物序列見表1，擴增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 32 s，40個循環。PCR擴增完成后，采用按2-ΔΔCt相對定量計算miR-124及內參U6 RNA的表達。

4. 肺動脈組織van Gieson染色

左肺組織經4%多聚甲醛-PBS液中固定，石蠟切片后行van Gieson染色，由2名研究人員在光鏡下觀察肺組織病理變化。在高倍鏡（400倍）下觀察肺血管形態，對外徑在25～100 μm的肺小動脈進行拍照（為避免偏倚，拍照者對實驗分組情況不知情）。使用圖片處理軟件測量肺內小動脈的中膜以及血管外徑的長度，計算二者的比值即為中膜/外徑比值。每張切片隨機選取10～15個肺小動脈，分別選取血管外徑在25～50 μm、51～100 μm

肺內小動脈，對其中膜/外徑比值進行統計分析，以了解不同大小的肺內小動脈重構嚴重程度。

5. 蛋白免疫印跡法檢測

取約50 mg大鼠右肺組織，剪碎后加入組織蛋白裂解液裂解，置于冰上反復充分研磨，離心后取上清液，考馬斯亮藍法測蛋白質濃度。按試劑盒說明書步驟操作，分別加入抗IL-6、GAPDH、STAT3及p-STAT3抗體（均為1∶1 000），4℃孵育過夜，洗膜后加入山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育，TBST溶液再次洗膜后用ECL發光液進行發光顯影。凝膠成像系統拍照后，使用Image J軟件對各條帶進行測量和分析。

三、統計學處理

使用SPSS 23.0分析數據。計量資料經檢驗呈正態分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t法。P <

0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、miR-124在4組大鼠肺組織中的表達

4組大鼠肺組織中miR-124表達水平比較差異有統計學意義（F = 192.843，P < 0.05）。相比于control組，miR-124在MCT+ NS組和MCT+GFP組大鼠的肺組織中表達減少（P均< 0.05）；相比于MCT+GFP組，miR-124在MCT+miR-124組大鼠的肺組織中表達增加（P < 0.05）。見圖1。

二、miR-124過表達對PAH大鼠RVSP和RVHI的影響

MCT注射5周后達到實驗終點時，control組大鼠均存活，MCT+NS組、MCT+AAV-GFP組和MCT+AAV-miR-124組分別有2、2、1只大鼠死亡，死亡原因考慮為右心衰竭。各組大鼠血流動力學檢測及RVHI結果提示，MCT+NS組大鼠的RVSP高于control組［（71.9±9.9） vs. （23.2±1.9） mmHg，P < 0.01）；MCT+miR-124組RVSP低于MCT+GFP組［（49.3±7.7） vs. （75.1±17.9） mmHg，P < 0.01）］（圖2A）。MCT+NS組大鼠右心肥厚指數（RVHI）高于control組（0.60±0.10 vs. 0.24±0.02，P < 0.01），

MCT+miR-124組RVHI低于MCT+GFP組（0.45±

0.08 vs. 0.59±0.08，P < 0.01）（圖2B）。4組大鼠的平均動脈壓和心率的比較差異均無統計學意義（F值分別為2.371、0.837，P均> 0.05）（圖2C、D）。

三、miR-124過表達對PAH大鼠肺血管重構的影響

肺組織切片行van Gieson染色結果提示，control組大鼠肺內血管外徑在25～50 μm（圖3A）和51～100 μm（圖3C）的小肺動脈管壁結構清楚，厚度正常，中膜未見明顯增厚，MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組肺小動脈中膜明顯增厚、管腔變窄，提示MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組大鼠肺內小動脈發生肺血管重構，而MCT+miR-124組大鼠肺動脈中膜肥厚程度明顯減輕。

血管外徑在25～50 μm （圖3B）和51～100 μm（圖3D）的肺內小動脈中膜/外徑比值統計結果提示：MCT+NS組和MCT+GFP組肺內小動脈中膜/外徑比值高于control組，而MCT+miR-124肺內小動脈中膜/外徑比值低于MCT+GFP組。4組間比較差異有統計學意義（F值分別為33.170和49.680，P均< 0.05）。

四、miR-124過表達對PAH大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3表達的影響

蛋白免疫印跡檢測結果提示，MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3蛋白的相對表達量高于control組（P < 0.05）；MCT+AAV-miR-124組IL-6和p-STAT3蛋白的相對表達量低于MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組（P <

0.05），IL-6和p-STAT3蛋白在4組間比較差異有統計學意義（F值分別為21.94和31.88，P均< 0.05）。見圖4。

討 論

本研究顯示，MCT經腹腔注射后可導致大鼠出現嚴重的PAH和肺血管重構，而采用AAV作為載體介導miR-124過表達可降低MCT誘導的大鼠右心室收縮壓和肺血管重構程度。模型組IL-6和p-STAT3的表達與正常對照組相比明顯上調，而miR-124的過表達可下調MCT誘導的PAH大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3的表達，提示AAV介導的miR-124過表達降低PAH的機制可能與其下調IL-6和p-STAT3的表達有關。

miRNA是一類長度18～23 nt的非編碼單鏈小分子RNA，參與細胞的增殖、分化和凋亡、免疫反應、腫瘤發生等多種病理生理過程［7］。miRNA在呼吸系統可通過不同的信號通路和靶點影響氣道平滑肌細胞的增殖和遷移、上皮細胞的增殖和黏附、成纖維細胞增生、氣道血管生成、杯狀細胞的分泌和氣道炎癥的發生，從而影響氣道重構［8］。miR-124是在神經細胞中表達最豐富的微RNA。但近年來人們發現miR-124在PAH中起著非常重要的作用［9］。多項研究發現：不管是在PAH患者還是PAH動物模型中，肺動脈外膜成纖維細胞和肺血管平滑肌細胞的miR-124表達均下調，而過表達miR-124能減輕肺血管成纖維細胞和血管平滑肌細胞的增殖和遷移［10］。本研究提示，AAV介導的miR-124的過表達降低了MCT誘導的PAH，減輕了肺內小動脈血管中膜/外徑比，即改善了肺血管重構，其機制可能與miR-124的過表達抑制了肺動脈血管平滑肌細胞和成纖維細胞的異常增殖和遷移有關，其具體機制仍需更多研究明確。

STAT3是一種參與多種生物學功能的轉錄因子，其能將細胞外信號轉導至細胞核，將靶基因的轉錄激活，從而促進細胞增殖、存活、凋亡和炎癥［11］。多項研究表明，促炎細胞因子IL-6在PAH的發病機制中發揮重要作用［12-13］。IL-6和受體結合后，可以使STAT3的酪氨酸705位點發生磷酸化，p-STAT3可促進肺動脈平滑肌細胞的異常增殖并減少其凋亡［14］。Wang等［15］的研究發現，過表達miR-124可以通過靶向調節STAT3降低促炎細胞因子IL-6的表達。另一項研究發現在口腔扁平苔蘚間充質干細胞中，miR-124-3p類似物過表達可降低IL-6和STAT3的表達，而miR-124-3p的低表達則會產生相反的結果［16］。本研究中，與control組相比，加入MCT的肺組織中p-STAT3和IL-6的表達增加。與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組IL-6和p-STAT3蛋白的表達均下調。這提示miR-124過表達改善MCT誘導的PAH的作用機制可能與其調節IL-6/STAT3信號通路分子的表達有關，未來仍需要更多的研究予以明確。

綜上所述，AAV介導的miR-124過表達可減輕野百合堿誘導的肺動脈高壓和肺血管重構，其機制可能是通過調控IL-6/STAT3信號通路實現的。本研究有望為肺動脈高壓和肺血管重構的基因治療提供實驗基礎。

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（收稿日期：2023-03-01）

（本文編輯：林燕薇）