基于非靶向代謝組學解析肉桂精油納米乳抑制假單胞菌CM2 作用機制研究

趙電波 ，馬燕青，王少丹，王雯雯

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量與安全控制重點實驗室，河南鄭州 450001）

植物精油（essential oil，EOs）是從植物的根、莖、葉、花、果實等部分提取的含有揮發性芳香物質的濃縮親脂液體[1]。常見的植物精油包括肉桂精油、迷迭香精油、牛至精油、丁香精油和孜然精油等[2-3]。近年來，EOs 在食品抗菌保鮮中的應用受到了廣泛關注[4]，但其存在揮發性強、水溶性差等缺點，制約了其在食品保鮮領域的應用[5]。研究證實，納米乳化技術能夠有效提高EOs 的水溶性及穩定性[6]。目前，關于EOs 納米乳的研究多集中于制備優化和抑菌活性評價等方面[7-8]，但其代謝組水平上的抗菌機制研究尚不充分。

代謝組學是對某一生物、組織或細胞中的所有低分子量代謝產物進行定性與定量分析的一門科學。代謝組學以指標分析為基礎，高通量檢測為手段，通過研究生物體內代謝物的種類與數量及其變化規律來闡述機體在正常生命狀態及環境變化后的代謝過程，從而揭示生物體內的生命現象及其內在規律[9]。近年來，代謝組學被廣泛應用于不同抗菌劑作用機制等方面的研究[10-12]。例如，Li 等[11]發現，經終濃度為150 mg/L 的丁香酚納米乳處理48 h 后，意大利青霉菌（Penicillium italicum）有34 種代謝物下調；研究發現，丁香酚納米乳干擾了P. italicum的三羧酸循環、脂質代謝和蛋白質合成等途徑。經終濃度為1.5 μL/mL 的芳樟醇處理2 h 后，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）出現170 種差異代謝物，其中上調81 種，下調89 種；代謝通路分析表明，芳樟醇干擾了S. putrefaciens的三羧酸循環、糖酵解途徑、氨基酸代謝、泛酸和輔酶A 合成等代謝途徑[12]。

肉桂精油提取自肉桂皮、肉桂葉等，來源廣泛、安全環保、具有良好的抗菌和抗氧化特性[13]。前期研究表明，肉桂精油納米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）對肉源假單胞菌腐 CM2（Pseudomonas deceptionensisCM2）具有較強的抑菌效果，但相關作用機制尚不明確[14]。因此，本研究采用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱聯用技術（ ultrahigh-performance liquid chromatograph Q extractive mass spectrometry， UHPLC-QE-MS） 對CON 處理組P. deceptionensisCM2 胞內代謝產物進行分離和檢測，結合多元統計分析確定差異代謝產物種類，通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對差異代謝物質進行通路富集分析，系統揭示CON 抑制P. deceptionensisCM2 的作用機制，以期為CON 在食品安全控制領域中的應用提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

P. deceptionensisCM2 菌株 由本實驗室分離自腐敗雞肉；殼聚糖、果膠、肉桂精油 上海源葉生物科技有限公司；營養瓊脂（nutrient agar，NA）、營養肉湯（nutrient broth，NB） 北京路橋技術有限責任公司；Tween 80、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和冰乙酸北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈 美國Thermo Fisher Scientific 公司；L-2-氯苯丙氨酸上海恒創生物科技有限公司。

5424R 型低溫高速離心機 德國Eppendorf 公司；LD2M-60KCS 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SHP-250 型生化培養箱 上海鴻都電子科技有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；VC750 型超聲波破碎儀 美國Sonic 公司；UltraturraxT25 型高速分散器 德國IKA 公司；THZ-103B 型恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板讀數儀 瑞士Tecan 公司；QE plus 型高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；ACQUITY UPLC I-Class plus 型色譜柱 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 用無菌接種環挑取活力旺盛的P. deceptionensisCM2 單菌落接種于NB 培養基中，于30 ℃、150 r/min 搖床中恒溫振蕩培養12 h。取25 mL 培養物于50 mL 離心管，離心（4 ℃，8000×g，10 min）收集菌體。用無菌NaCl 溶液（0.85%，w/v）洗滌菌體2 次，離心同上。將所得菌體重懸于濃度為0.01 mol/L 的無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）并混勻，調整菌懸液的OD600值于1.2～1.3 之間，制成活菌數約為8 lg CFU/mL 的菌懸液備用。

1.2.2 CON 制備 參考He 等[15]的方法制備CON。稱取0.6 g 殼聚糖粉末溶于100 mL 乙酸溶液（0.5%，v/v），室溫下磁力攪拌（450 r/min，2 h）得到殼聚糖溶液（0.6%，w/v）。稱取1.0 g 的果膠粉末溶于100 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌2 h 得到果膠溶液（1%，w/v）。將殼聚糖和果膠溶液1:1（v/v）混合，作為乳液基質，然后將肉桂精油加入基質溶液中，再加入吐溫80 作為乳化劑，吐溫80 與精油的比例為1:4（v/v），磁力攪拌20 min 至分散均勻。然后用高速均質機在10000 r/min 條件下均質2 min，形成粗乳液。通過功率為450 W 的超聲波設備處理7.5 min，進一步均質乳化即得CON，于4 ℃冷藏備用。

1.2.3 MIC 和MBC 測定 采用二倍稀釋法測定CON的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）[16]。在96 孔細胞培養板的前三排每孔各加入100 μL NB 培養基，然后在每排第一孔中加入100 μL CON（稀釋至肉桂精油濃度為8 μL/mL），用移液器吹打混勻后吸取100 μL 混合溶液置于第二孔中，照此添加至第六孔，吸取第六孔中100 μL 混合溶液棄去，然后在每孔中加入100 μL 濃度約為8 lg CFU/mL 的菌懸液，此時每孔CON 中的肉桂精油濃度從左至右依次為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 和0.063 μL/mL。將96 孔細胞培養板置于37 ℃培養24 h，通過多功能微孔板讀數儀觀察供試菌的生長情況，以完全沒有微生物生長的最低的肉桂精油濃度作為MIC。在測得MIC 的基礎上，吸取100 μL 上述無微生物生長孔中的液體培養基涂布于平板上，置于37 ℃培養24 h，以平板上無菌落生長的最低的肉桂精油濃度作為MBC。

1.2.4 CON 處理P. deceptionensisCM2 菌懸液經終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，于4 ℃、10000×g 離心5 min，對照組用無菌水處理，收集細菌沉淀。菌體經PBS（4 ℃預冷）洗滌3 次后，采用液氮進行凍存處理。

1.2.5 胞內代謝物的提取和制備 參考周繼福等[17]的方法并適當改進。用1 mL 甲醇溶液（-20 ℃預冷，80%，v/v）將樣本轉移到玻璃樣品瓶中，加入200 μL 氯仿并混勻，采用冰浴超聲破碎3 min（功率為500 W）并全部轉移至1.5 mL 離心管，加入20 μL濃度為0.06 mg/mL 的L-2-氯苯丙氨酸溶液作為內標；經冰浴超聲提取20 min 并于-40 ℃靜置30 min后，于4 ℃、13000 r/min 離心10 min；吸取800 μL上清液裝入LC-MS 進樣瓶中揮干，加入300 μL 甲醇溶液（20%，v/v）復溶并于-20 ℃下靜置2 h，離心同上，吸取150 μL 上清液，經0.22 μm 有機相針孔過濾器過濾后，保存至-80 ℃冰箱備用。將對照組和1×MIC 處理組樣品提取液進行等體積混合作為質控樣本（quality control，QC）。

1.2.6 液相色譜-質譜分析 采用ACQUITY UPLC I-Class plus 超高效液相串聯QE plus 高分辨質譜儀組成的液質聯用系統進行分析。

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流動相A 為水（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈（含0.1%甲酸）；流速為0.35 mL/min；進樣體積為2 μL。梯度洗脫程序為[18]：0～2.0 min，95% A；2.0～4.0 min，95%～70% A； 4.0～8.0 min， 70%～50% A； 8.0～10.0 min，50%～20% A；10.0～14.0 min，20%～0% A；14.0～15.0 min，100% B；15.0～16.0 min，95% A。

1.2.6.2 質譜條件 采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）的QE Plus 質譜儀分別在正負離子電離模式下采集數據[19]。正離子和負離子模式下的噴霧電壓分別為3800 和-3000 V；毛細管溫度為320 ℃，輔助氣加熱器溫度為350 ℃；正負離子的鞘氣流速分別為40 和35 arb，輔助氣流速分別為10和8 arb；S-lens RF 電壓為50 V；質譜掃描范圍為100～1200 m/z，一級掃描分辨率為70000 FWHM，二級掃描分辨率為17500 FWHM；歸一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）和分步碰撞能量（stepped NCE）為10、20 和40 eV。

1.2.6.3 質控樣品監測 為了評價在上機過程中分析系統的穩定性，在待測樣本進樣前、中、后上機檢測QC 樣品。可通過QC 樣本的重復性以考察整個分析過程中儀器穩定性，保證結果的可靠性[20]。

1.3 數據處理

每組樣品做4 次生物學平行試驗；使用 SPSS 24.0 軟件進行統計分析，采用t檢驗進行變量統計分析。

1.3.1 UPLC-MS 原始數據預處理 將原始UPLCMS/MS 數據導入Progenesis QI v2.3 軟件（Nonlinear Dynamics, Newcastle，UK）進行基線過濾、積分、保留時間校正、峰識別、峰對齊和歸一化等工作。采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）及OPLS-DA 置換檢驗區分處理組和對照組代謝輪廓的總體差異。

1.3.2 差異代謝物鑒定 使用歐易生物云平臺（https://cloud.oebiotech.com/task/）配合使用人類代謝組數據庫（The Human Metabolome Database,HMDB）、脂質圖譜（Lipidmaps）（v2.3）和EMDB2.0等數據庫注釋Progenesis QI v2.3 數據處理后的峰來進行差異代謝物的鑒定。基于其分析結果可得到變量權重值（variable importance in projection，VIP）＞1 的代謝物。最后，通過差異倍數（fold change，FC）分析得到不同處理間代謝物的變化倍數。CON 處理組與對照組之間的差異代謝物篩選標準為VIP＞1、t檢驗的P＜0.05 且|log2FC|＞0。

1.3.3 代謝通路分析 通過MetaboAnalyst 4.0 在線數據處理軟件（http://www.metaboanalyst.ca）結合KEGG 數據庫（https://www.kegg.jp/kegg/）等進行代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 CON 抗菌活性分析

采用二倍稀釋法測得CON 抑制P. deceptionensisCM2 的MIC 為0.125 μL/mL，MBC 為0.250 μL/mL。在后續的實驗中，選用經終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后的P. deceptionensisCM2 進行代謝組學分析。

2.2 多元統計分析結果

2.2.1 PCA 結果 PCA 是一種非監督分析，能夠反應數據的原始情況，有利于了解數據的整體情況并從整體上進行把握。對代謝物進行主成分分析，可從總體反映樣本組間和組內的變異度，觀察樣本間的總體分布趨勢，判斷可能存在的離散點[21]。采用PCA 評價對照組和CON 處理組P. deceptionensisCM2 細胞樣本的變異度，觀察不同處理組樣本之間的整體趨勢分布，結果見圖1。

圖1 對照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖1 可知，所有樣本均處于95%置信區間（圖1 中橢圓形區域）內，各組樣本之間有明顯的分離趨勢，組內樣本較為緊密；PC1 得分為56.4%，PC2 得分為15.6%。模型解釋率（R2X）是判別PCA 模型質量好壞的主要參數，該值代表降維后的數據對原始數據的解釋率，該值越接近1 越理想，一般認為R2X 大于0.5 說明模型效果較好[22]。經計算，對照組和CON 處理組的R2X 為0.797，表明上述模型擬合效果良好。以上結果表明，對照組和肉桂精油納米乳處理組樣本在PCA 得分圖上區分明顯，組內樣本彼此靠近，且PCA 模型穩定可靠。

2.2.2 PLS-DA 結果 PLS-DA 是一種有監督的判別統計方法，該方法運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣本分組之間的關系模型，來實現對樣品類別的預測[23]。PLS-DA 加入分組變量，可彌補PCA 方法的不足。采用PLS-DA 模型進行對照組和CON 處理組P. deceptionensisCM2 細胞樣本進行有監督的統計分析，結果見圖2。

圖2 對照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的PLS-DA 得分圖Fig.2 PLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖2 可知，對照組和CON 處理組的樣本點距離較遠并有明顯的聚集趨勢，表明兩組樣品在代謝輪廓上存在明顯差異且樣本全部處于95%置信區間。PLS-DA 的擬合參數包括R2X、解釋率R2Y 和預測率Q2。計算結果表明，PLS-DA 正負離子模式的R2X 為0.851，R2Y 為1，Q2為0.995。上述3 個模型參數指標均接近1，表明此模型擬合效果良好，具有很強的解釋和預測能力，能有效區分對照組和CON 處理組樣品。

2.2.3 OPLS-DA 結果 相對于PLS-DA，OPLS-DA模型的解析能力和有效性更高[24]。進一步采用OPLS-DA 模型對各組P. deceptionensisCM2 細胞樣本差異代謝物進行有監督的統計分析，OPLSDA 得分結果見圖3。

圖3 對照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖3 可知，對照組和CON 處理組的樣本點距離較遠，并有明顯的聚集趨勢，說明兩組樣品在代謝輪廓上存在差異。一般認為，當R2和Q2越接近1 時，模型越穩定可靠[25]。經計算，OPLS-DA 中R2X 為0.851，表明上述模型擬合效果良好；R2Y 為1，表明此模型的解釋率高；Q2為0.993，表明此模型的預測能力很高。為驗證建立的OPLS-DA 模型的預測能力和解釋能力，選擇置換檢驗進行驗證，對OPLS-DA 模型的數據進行隨機200 次響應排序檢驗，以置換檢驗的置換保留度為橫坐標，R2或Q2值為縱坐標，得到的置換檢驗結果見圖4。

圖4 對照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的OPLS-DA 模型置換檢驗Fig.4 Permutation test of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells using OPLS-DA model

由圖4 可知，OPLS-DA 模型的R2為0.923，Q2為-0.014，表明OPLS-DA 模型符合樣本數據的真實情況，沒有出現“過擬合”現象。以上結果說明OPLS-DA 模型具備很強的解釋和預測能力，可以用來區分對照組和CON 處理組樣品，結果可用于后續的差異代謝物分析。

2.3 差異代謝物分析

OPLS-DA 模型中的VIP 反映了每種代謝物在不同組之間相互關聯的顯著性，以區分對照組和處理組，代謝物VIP 值越高表明對區分的貢獻越大[26]。本研究以OPLS-DA 模型第一主成分的VIP＞1、FC＞1.0 且P＜0.05 為條件對差異代謝產物進行篩選，并繪制火山圖，結果見圖5。結果表明，與對照組細胞相比，經終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，在P. deceptionensisCM2 細胞共檢測到380 種差異性代謝物，主要包括雜環化合物、芳香族化合物、脂類和類脂質分子、有機酸及其衍生物、核苷酸、苯丙類和聚酮類化合物等；含量顯著升高的差異性代謝物有309 種，主要包括2-苯乙醇、尿嘧啶、L-天冬酰胺、D-脯氨酸和四磷酸二鳥苷等；含量顯著降低的差異代謝物有71 種，主要包括L-纈氨酸、檸檬酸、N-乙酰鳥氨酸、煙酰胺和氧化型谷胱甘肽等。Chen 等[27]發現，經終濃度為0.4 mg/mL 的肉桂精油處理6 h 后，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有74 種代謝物存在顯著差異，主要包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂類等，其中上調29 種，下調45 種。

圖5 對照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 的差異代謝產物火山圖Fig.5 Volcano plot for the differential metabolites between the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

2.4 代謝通路富集分析結果

為確定P. deceptionensisCM2 經CON 處理后發生變化的相關代謝通路，基于KEGG 數據庫結合Metaboanalyst 軟件對定性的差異化合物進行代謝通路富集分析[28]。結果表明，對照組和CON 處理組P.deceptionensisCM2 差異表達代謝物中顯著富集的代謝通路共有49 條，其中前20 條代謝通路見圖6。

圖6 TOP-20 代謝通路富集圖Fig.6 TOP-20 enrichment of metabolic pathways

由圖6 可知，共有13 條代謝通路條柱高于藍線，表明與對照組相比，經濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細胞有13 條代謝通路具有顯著性差異。與對照組相比，CON 處理組細胞發生變化的代謝通路主要涉及氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸等）代謝、嘌呤代謝、氨基糖代謝、嘧啶代謝等。Li 等[29]也得到了類似的結果，經1.5 mL/L 的芳樟醇處理2 h 后，莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）發生顯著性變化的代通路主要涉及丙酮酸代謝、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉化、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A 生物合成等。

如表1 所示，經終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細胞有13 條代謝通路發生顯著變化。在表1 中，代謝通路的P值反映了其富集的顯著性。篩選顯著性富集通路；以富集因子（rich factor）為橫坐標，差異代謝通路名稱為縱坐標，繪制氣泡圖，結果見圖7。

表1 代謝通路富集結果Table 1 Enrichment of metabolic pathways

圖7 代謝通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram for metabolic pathwayenrichment analysis

在圖7 中，富集因子反映了代謝通路的富集程度；每個氣泡代表一個代謝途徑；氣泡越大，表示富集到該通路上的代謝物數目越多。由圖7 可知，以富集因子＞0.1 和P＜0.05 為差異代謝通路篩選條件，篩選出4 條差異代謝通路，分別為：a.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝；b.泛酸和輔酶A 生物合成；c.磷酸轉移酶系統；d.氧化磷酸化代謝。上述4 條代謝途徑均與氨基酸代謝和ATP 合成有關。氨基酸代謝在維持細胞生命活動方面具有重要作用[30]。泛酸是CoA生物合成的關鍵前體，CoA 是一種重要的輔助因子，參與生物體內碳水化合物、脂肪酸、蛋白質和能量的代謝，包括TCA 循環和氧化磷酸化[31]。以上結果表明CON 處理可能通過抑制胞內氨基酸和能量代謝而導致P. deceptionensisCM2 死亡。

2.5 差異代謝物的代謝通路分析結果

通過KEGG pathway mapper 功能對差異代謝通路進行分析，結果見圖8。

圖8 CON 處理后P. deceptionensis CM2 細胞代謝通路變化Fig.8 Changes in the metabolic pathways of CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖8 可知，細胞的碳水化合物代謝途徑包括糖酵解途徑和三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA 循環），在細胞能量代謝等生理活動中具有重要作用[32]。TCA 循環是細胞能量生產的代謝樞紐。由圖8 可知，泛酸、檸檬酸、L-天冬氨酸、L-天門冬酰胺和L-纈氨酸等關鍵代謝物顯著下調，表明CON 處理抑制了P. deceptionensisCM2 的氨基酸和ATP合成，進而導致能量生產無法正常進行，最終導致細胞死亡。

3 討論與結論

與對照組相比，經終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細胞共出現380 種差異性代謝物，主要包括雜環化合物、芳香族化合物、脂類和類脂質分子、有機酸及其衍生物、核苷酸、苯丙類和聚酮類等；共富集到13 條差異顯著的代謝通路，涉及氨基酸、嘌呤、氨基糖和嘧啶等物質代謝，表明CON 失活P. deceptionensisCM2 可能與其抑制內氨基酸的合成和能量代謝等生理活動有關。在今后的研究中，應綜合運用蛋白質組學、轉錄組學等方法進一步闡明CON 失活P. deceptionensisCM2 的作用機制。此外，還應系統評價CON 處理對食品表面微生物的殺滅效果及對食品營養、感官品質及貨架期等指標的影響，探究脂質、蛋白質等食品組分對CON 殺菌效果的影響及作用機制。