2019—2021年四川成都某醫院淋病奈瑟菌對大觀霉素、阿奇霉素及頭孢菌素類藥物敏感性檢測及結果分析

王有為?楊陽?趙薇?陳媛瑋?李紅霞?張欣?雍剛

摘要：目的 檢測我院2019—2021年淋病奈瑟菌臨床分離菌株對大觀霉素、阿奇霉素及頭孢菌素類藥物的敏感性，為淋病的治療和防控提供參考。方法 收集并保存淋病奈瑟菌臨床分離株，瓊脂稀釋法和微量肉湯稀釋法測定大觀霉素、阿奇霉素、頭孢曲松和頭孢克肟的最小抑菌濃度（ MIC） ，分析比較菌株對各藥物的耐藥率或低敏率。結果 2019—2021年共分離收集淋病奈瑟菌菌株279株。其中未發現對大觀霉素的耐藥菌株；發現對阿奇霉素耐藥菌株31株，耐藥率分別為16.00%、8.82%和8.11%，平均耐藥率為11.11%；發現對頭孢曲松低敏菌株43株，低敏率分別為12.00%、14.71%和18.92%，平均低敏率為15.41%；發現對頭孢克肟低敏菌株27株，低敏率分別為4.00%、2.94%和18.92%，平均低敏率為9.68%。每年發現同時對頭孢曲松低敏和阿奇霉素耐藥的菌株數量均為2株，占比分別為2.00%、2.94%和1.80%，總體占比2.15%。結論 大觀霉素和頭孢曲松仍適合本地區作為治療淋病的一線藥物，需關注本地區淋病奈瑟菌對頭孢曲松低敏率的逐年增長趨勢。

關鍵詞：淋??；淋病奈瑟菌；藥物敏感性檢測；微量稀釋法、最小抑菌濃度

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

The analysis of antimicrobial susceptibility test of Neisseria gonorrhoeae to spectinomycin， azithromycin and cephalosporins in one hospital of Chengdu， Sichuan Province from 2019 to 2021

Wang You-wei， Yang Yang， Zhao Wei， Chen Yuan-wei， Li Hong-xia， Zhang Xin， and Yong Gang

（Department of Laboratory Medicine， Sichuan Provincial Peoples Hospital，

University of Electronic Science and Technology of China， Chengdu 610031）

Abstract Objective To test the susceptibility of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates to spectinomycin， azithromycin， and cephalosporins in our hospital from 2019 to 2021， and provide a reference for treatment， prevention， and control of gonorrhea. Methods Clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae were collected and preserved， and the minimum inhibitory concentration （MIC） of spectinomycin， azithromycin， ceftriaxone， and cefixime were determined by the agar dilution method and the broth dilution method， and the drug resistance rate or low sensitivity rate of strains to each drug was analyzed. Results A total of 279 Neisseria gonorrhoeae strains were isolated and collected from 2019 to 2021. There was no spectinomycin-resistant strain. Thirty-one strains were found to be resistant to azithromycin， and the drug resistance rates were 16.00%， 8.82%， and 8.11% from 2019 to 2021， with an average azithromycin-resistance rate of 11.11%.? Forty-three strains were found to be hyposensitive to ceftriaxone， and the hyposensitivity rates were 12.00%， 14.71%， and 18.92% from 2019 to 2021， with an average hyposensitivity rate of 15.41%.? Twenty-seven strains were found to be hyposensitive to cefixime， and the hyposensitivity rates were 4.00%， 2.94%， and 18.92% from 2019 to 2021， and the average hyposensitivity rate was 9.68%.? Two ceftriaxone hypoallergenic and azithromycin resistant strains were found each year， accounting for 2.00%， 2.94%， and 1.80% from 2019 to 2021， and the overall ratio was 2.15%. Conclusion Spectinomycin and ceftriaxone are still suitable as first-line drugs for the treatment of gonorrhea in this region. It is necessary to pay attention to the increasing trend of low sensitivity rate of Neisseria gonorrhoeae to ceftriaxone with each passing year in this region.

Key words Gonorrhea; Neisseria gonorrhoeae; Antimicrobial susceptibility test; Microdilution method; Minimal inhibitory concentration

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae， NG）簡稱淋球菌，是淋病的病原菌。關于淋病的治療，WHO和美國CDC的治療指南中推薦頭孢曲松（ceftriaxone， CRO）與阿奇霉素（azithromycin， AZM）的聯合方案，而在我國未將阿奇霉素推薦為治療淋病的一線藥物[1]。近年來，超級淋球菌菌株[2-3]、頭孢菌素耐藥型（FC428）淋球菌[3-4]，以及對頭孢曲松和阿奇霉素雙重高度低敏的淋球菌[5-6]的出現，給淋病的治療帶來更大的挑戰。淋球菌耐藥已成為全球嚴重的公共衛生問題[7]。本文就2019—2021年四川省人民醫院皮膚病性病實驗室分離的淋球菌菌株進行大觀霉素（spectinomycin， SPE）、AZM以及CRO、頭孢克肟（cefixime， CFM）藥物敏感性檢測，對其檢測結果進行總結分析，為淋病的治療和防控提供依據。

1 材料

1.1 菌株來源

檢測菌株來自2019—2021年四川省人民醫院淋病初診患者，由本院皮膚病性病實驗室分離培養。

1.2 質控菌株

為了每1批MIC檢測的質量控制，檢測中參加中國疾病預防控制中心性病控制中心組織的淋球菌耐藥監測室間質量評價活動。2019年質控菌株編號：19QA1、19QA2、19QA3；2020年質控菌株編號：20QA1、20QA2、20QA3；2021年質控菌株編號：21QA1、21QA2、21QA3

1.3 抗菌藥物

本研究選擇SPE、CRO、CFM和AZM等4種抗生素，藥粉由中國疾病預防控制中心性病控制中心參比實驗室提供。

1.4 主要儀器和試劑

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統、奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡（NH卡）均用于臨床分離初步鑒定菌株的鑒定；GC基礎培養基、血紅蛋白粉、生長添加劑等均購自英國Oxoid公司，用于T-M選擇性培養基和瓊脂稀釋法藥敏培養基的配制；淋球菌藥物MIC測試板及其配套稀釋液、MH肉湯等，購自珠海金標醫學檢驗技術有限公司（批號：20211124），分別含SPE（藥物濃度128～0.06 mg/L）、CRO（藥物濃度1～0.0005 mg/L）、AZM（藥物濃度8 ～0.004 mg/L）及CFM（藥物濃度1～0.0005 mg/L）梯度濃度微孔各12孔，用于微量稀釋法藥物MIC測定。

2 方法

2.1 菌株的分離培養和保存

采集疑似淋病患者生殖道等部位分泌物樣本，采用T-M淋球菌選擇性培養基培養24～48 h，得到菌株經革蘭染色、氧化酶試驗初步鑒定。當氧化酶陽性、革蘭染色鏡檢為陰性雙球菌時，增菌后采用奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡（NH卡）在全自動微生物鑒定系統鑒定。確認后菌株洗脫于30%甘油牛肉浸液保存液中，-80℃凍存備用。

2.2 抗生素液的配制

SPE：稱取38.554 mg藥粉（純度：66.4%），溶劑為2 mL注射用純水，配制成12800 μg/mL原液。將原液倍比稀釋呈濃度為6400～400 μg/mL 5個濃度的工作液。

CRO：稱取2.160 mg藥粉（純度：92.6%），溶劑為1 mL注射用純水，配制成2000 μg/mL原液。將原液10倍稀釋為200 μg/mL，再倍比稀釋得到50～0.8 μg/mL等7個濃度的工作液。

AZM：稱取1.691 mg藥粉（純度：94.6%），溶劑為2 mL無水乙醇，配制成800 μg/mL原液。將原液倍比稀釋為400～3.125 μg/mL等8個濃度的工作液。

CFM：稱取2.024 mg藥粉（純度：98.8%），溶劑為1 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，配制成2000 μg/mL原液。將原液20倍稀釋至100 μg/mL，再倍比稀釋得到50～0.8 μg/mL等7個濃度的工作液。

淋球菌藥物MIC測試板已含有梯度濃度的藥物，直接使用。

2.3 藥敏培養基的配制

在培養皿外底部做好抗生素名及濃度標記，分別吸取抗生素工作液150 μL加入到對應培養皿中，再傾注經高壓滅菌冷卻至50℃左右的150 mL GC瓊脂培養基，混勻，備用。

2.4 菌懸液的配制

凍存細菌采用T-M培養基，在（36℃±1℃）、5%CO2條件下培養時間18～24 h，經過復蘇、純化、增菌等過程，得到細菌經NH卡鑒定后方可使用。將新鮮菌苔洗于預溫0.9%生理鹽水或MIC測試板配套稀釋液中，調整菌液濁度為0.5 CFU/mL，備用。

2.5 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）測定及敏感性判定標準

2019—2020年采用WHO淋球菌耐藥監測規劃推薦的瓊脂稀釋法測定MIC[8]。2021年采用微量稀釋法測定MIC，測定方法參照淋球菌MIC測試板試劑盒說明書。參照WHO西太平洋地區（簡稱西太區）淋球菌耐藥性監測項目判定標準：大觀霉素：Susceptible（S）≤64 mg/L；Resistant （R）≥128 mg/L；阿奇霉素：S≤0.05? mg/L；R≥1 mg/L；頭孢曲松：S＜0.125 mg/L；Decreased Susceptible （DS）≥0.125 mg/L。頭孢克肟：S＜0.25 mg/L；DS≥0.25 mg/L。

2.6 統計學處理

采用SPSS statistics23統計軟件，定量資料比較使用t檢驗。P<0.05表示具有統計學差異。耐藥率、低敏率等使用百分比表述。

3 結果

3.1 一般資料

2019—2021年共檢測淋球菌279株。其中254株來源于男性尿道分泌物、1株來源于男性眼部分泌物、23株來源于女性宮頸管分泌物、1株來源于2歲女童外陰分泌物。感染者中男女性別比例10.625：1，年齡最大71歲、最小2歲，平均年齡33.21±11.851歲。男性和女性感染者平均年齡無顯著性差異（t=1.973、P=0.050）。男性患者中有22例有同性性行為，占所有男性感染者的8.66%。主訴感染地點主要在本?。?8.2%，273/279），有62例患者在一個月內使用過抗菌藥物。

3.2 MIC結果

279株淋球菌中未發現對大觀霉素耐藥的菌株；發現頭孢曲松低敏株43株、頭孢克肟低敏株27株；發現對阿奇霉素耐藥株31株。2019—2021年279株淋球菌對各監測藥物MIC結果分布見表1。淋球菌對各監測藥物敏感性及MIC50見表2。

3.3 對頭孢曲松低敏/阿奇霉素耐藥情況

2019—2021年，同時對頭孢曲松低敏（MIC≥0.125 mg/L）和阿奇霉素耐藥（MIC≥1 mg/L）的菌株數量均為2株，占比分別為2.00%（2/100）、2.94%（2/68）和1.80%（2/111）。淋球菌對頭孢曲松低敏率、對阿奇霉素的耐藥率以及同時對頭孢曲松低敏和對阿奇霉素耐藥的比例趨勢變化見圖1。

4 討論

本研究在2021年的藥物敏感性檢測中，使用了微量肉湯稀釋法，出現了方法上的不統一，是本文的缺點。2019—2021年，每年參加中國疾病預防控制中心性病控制中心組織的淋球菌耐藥監測質量控制計劃，結果均滿意。

近年來淋球菌對頭孢曲松等頭孢菌素類藥物低敏率和對阿奇霉素耐藥性的不斷增加，尤其分離到對阿奇霉素高度耐藥同時對頭孢曲松低敏菌株[9]，或同時對頭孢曲松和阿奇霉素高度低敏的菌株[5]，讓我們認識到淋球菌全球范圍內的耐藥現象不容小覷。

本研究顯示，2020年和2021年，本院分離淋球菌對阿奇霉素的敏感性基本一致，耐藥率分別為8.82%和8.11%，3年總體耐藥率為11.11%，低于潘露等[10]報道的浙江地區2016年的20.48%，和廣州地區2018年的16.15%[11]。與廣西北海地區2015—2019年[12]、浙江部分地區2013—2018年[13]耐藥率逐漸增加的情況相反，與趙靜[15]介紹的從2014—2018年逐年降低類似，本院2019—2021年分離淋球菌對阿奇霉素的耐藥率從2019年的16.0%[14]呈逐年降低趨勢。據不完全統計，2021年就診患者中，22例患者在一個月內有服用以左氧氟沙星、頭孢菌素類藥物等為主的抗生素，沒有1例使用過阿奇霉素。本院淋球菌對阿奇霉素耐藥率的降低是否與本地區醫生的習慣性用藥[16]以及患者對于抗生素的可獲得性等因素有關應做進一步的研究。

本院分離獲得的淋球菌對頭孢曲松低敏率在2019、2020和2021年分別為12.00%（12/100）、14.71%（10/68）和18.92%（21/111），低敏菌株的流行與我國臺灣地區[17]報告的趨勢一致，總低敏率為15.4%，低于浙江部分地區2018年報道的18.58%[13]、較江蘇地區2017—2018年的7.64%[18]高。2021年111株淋球菌對頭孢克肟敏感性顯著性降至81.98%，有12株菌的MIC≥1 mg/L，且均為頭孢曲松低敏菌株，與黎小東等[19]報道的敏感率81%相似。

本院分離獲得的淋球菌對阿奇霉素的耐藥率呈下降趨勢，且在2020—2021年間相對穩定，對頭孢菌素類藥物低敏率呈上升趨勢，且對頭孢克肟的敏感性降低，兩者趨勢呈現剪刀叉形態。對頭孢菌素類藥物低敏和對阿奇霉素耐藥的菌株數量和比率沒有明顯變化。這種趨勢與在美國2014—2018年間頭孢克肟耐藥率下降、阿奇霉素耐藥率上升；在歐洲2014—2018年間頭孢克肟、阿奇霉素耐藥率都上升；在澳大利亞和加拿大，頭孢曲松低敏/耐藥率下降與阿奇霉素耐藥率呈上升[20]的趨勢均不同，與我國廣州市2013—2018年阿奇霉素耐藥上升的趨勢[21]也相反。從部分患者自行服用左氧氟沙星等現象來看，筆者認為：出現上述趨勢，與當地的經濟水平、就醫行為、臨床認知和宣傳教育等相關。應加大淋病防治的宣傳教育，促進患者及時、規范就醫；加大淋球菌耐藥監測數據的臨床應用，指引和提升臨床用藥的科學性和準確性；提升全社會對抗生素耐藥會帶來的感染風險、醫療成本和社會防治成本增加[22]的認識，促進抗生素合理運用。

我國治療淋病的推薦方案是頭孢曲松或大觀霉素作為一線藥物單次給藥[1]。本研究顯示大觀霉素和頭孢曲松適合本地區作為治療淋病的一線藥物，但隨著頭孢菌素類藥物低敏率的增加，應加大淋球菌對抗生素敏感性檢測和監測力度，開展淋球菌耐藥機制研究和新藥開發、老藥新用探索，實施全社會多維度的淋病防治策略[23]。

參 考 文 獻

梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原體感染診療指南（2020年）[J]. 中華皮膚科雜志， 2020， （3）： 168-179.

Deguchi T， Yasuda M， Yokoi S， et al. Treatment of uncomplicated gonococcal urethritis by double-dosing of 200mg cefixime at a 6 hinterval[J]. J Infect Chemother， 2003， 9（1）： 35-39.

Chen S C， Han Y， Yuan L F， et al. Identification of internationally disseminated ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeaestrain FC428， China[J]. Emerg Infect Dis， 2019， 25（7）： 1427-1429.

Wang H R， Wang Y W， Yong G， et al. Emergence and genomic characterization of the ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae FC428 clone in Chengdu， China[J]. J Antimicrob Chemother， 2020， 75（9）： 2495-2498.

Naznin Mahmuda， Salam Md Abdus， Hossain Md Zahid， et al. Current status of gonococcal antimicrobial susceptibility with special reference to azithromycin and ceftriaxone： Report from a tertiary care hospital in Bangladesh[J]. Pak J Med Sci， 2018， 34（6）： 1397-1401.

Yuan Q， Li Y， Xiu L， et al. Identification of multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates with combined resistance to both ceftriaxone and azithromycin， China， 2017—2018[J]. Emerg Microb Infect， 2019， 8（1）： 1546-1549.

Unemo M， Del R C， Shafer W M. Antimicrobial resistance expressed by Neisseria gonorrhoeae： A major global public health problem in the 21st Century[J]. Microbiol Spectr， 2016， 4（3）， doi： 10.1128/microbiolspec.EI10-0009-2015.

WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee[M]. WHO Guidelines for the Treatment of Neisseria gonorrhoeae. Geneva; World Health Organization.

劉經緯， 朱小宇， 徐文綺， 等. 淋球菌對阿奇霉素耐藥現狀及耐藥機制的研究進展[J]. 中國艾滋病性病， 2019， 25（7）： 765-768.

潘露， 楊波， 趙建妹， 等. 231株淋球菌對阿奇霉素等6種抗生素耐藥觀察[J]. 中國艾滋病性病， 2018， 24（12）： 1224-1225.

黎小東， 梁景耀， 畢超， 等 .淋球菌130株對7種抗生素的耐藥性結果分析[J]. 中國皮膚性病學雜志， 2020， 34（1）： 60-63.

陳鎮， 鐘永軍， 朱邦勇， 等. 2015—2019年廣西北海地區淋球菌耐藥結果分析[J]. 皮膚病與性病， 2020， 42（3）： 325-327.

黃佳， 胡麗華， 趙建妹， 等. 2013—2018年浙江省部分地區性病門診淋病奈瑟菌耐藥監測結果分析[J]. 疾病監測， 2020， 35（5）： 430-434.

王有為， 李春花， 楊陽， 等. 瓊脂稀釋法檢測淋病奈瑟菌藥物敏感性及結果分析[J/OL]. 中國皮膚性病學雜志：1-10[2022-02-19].DOI：10.13735/j.cjdv.1001-7089.202108201.

趙靜. 淋球菌對阿奇霉素耐藥性及分子流行病學特征[J].中國衛生檢驗雜志， 2020， 30（20）： 2468-2469.

Han Y， Yin Y P， Zhou Y， et al. Nonadherence to national guidelines for antibiotic treatment of uncomplicated gonorrhea in China： Results from a nationwide survey[J]. Sex Transm Dis， 2018， 45（9）： 600-606.

Lin Y H， et al. Increased incidences of multidrug-resistant gonorrhea in Taiwanese men： Experiences from a single institute[J]. Urological Science， 2016， 27（2）： 86-90.

盧靜， 周瑩， 張之， 胡海洋， 等. 2017—2018年江蘇省淋球菌藥物敏感性分析[J]. 江蘇預防醫學， 2020， 31（4）： 368-370.

黎小東， 梁景耀， 曹文苓， 等. 100株淋球菌對7種抗生素的耐藥性結果分析[J]. 皮膚性病診療學雜志， 2020， 27（4）： 237-240.

陳紹椿， 張瑾， 王千秋， 等. 耐藥淋球菌的流行、防治與展望[J]. 皮膚科學通報， 2021， 38（1）： 35-42.

吳興中， 趙云虎， 覃曉琳， 等. 2018年廣東省淋球菌對阿奇霉素的耐藥性及2013—2018年廣州市耐藥趨勢[J]. 國際流行病學傳染病學雜志， 2019， 46（4）： 285-290.

姜婷婷， 陳祥生. 淋球菌耐藥性的結局影響研究進展[J]. 國際流行病學傳染病學雜志， 2019（4）： 331-334.

陳祥生， 尹躍平， 李新宇. 針對淋球菌耐藥的多角度研究：ROADMAP計劃[J]. 國際流行病學傳染病學雜志， 2019（4）： 264-267.

伍福恒， 林珠玲， 陳立新， 等. 微量稀釋法檢測淋球菌流行株藥敏試驗結果分析[J]. 皮膚性病診療學雜志， 2020， 27（2）： 98-101.

Shapiro M A， Heifetz C L， Sesnie J C， et al. Comparison of microdilution and agar dilution procedures for testing antibiotic susceptibility of Neisseria gonorrhoeae[J]. J Clin Microbiol， 1984， 20（4）： 828-830.