朝藿定B對BV2小膠質(zhì)細胞炎癥反應的作用及機制

胡子凡　谷雨　范育辰　戴瑋　陳文芳

［摘要］目的探討朝藿定B對脂多糖（LPS）誘導的BV2小膠質(zhì)細胞炎癥反應的抑制作用及雌激素受體（ER）特異性阻斷劑ICI 182，780的阻斷效應。方法常規(guī)培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞，加或不加朝藿定B、LPS、ICI 182，780處理，采用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5二苯基溴化四唑（MTT）比色法檢測細胞活力，實時聚合酶鏈反應檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）mRNA的表達。結(jié)果不同濃度朝藿定B對BV2小膠質(zhì)細胞活力沒有影響（P>0.05）。LPS可明顯上調(diào)促炎因子TNF-α（F=10.64，q=9.157，P<0.001）和IL-6（F=25.25，q=12.630，P<0.001）mRNA的表達；1、10 μmol/L朝藿定B預處理均能明顯抑制LPS誘導的TNF-α mRNA表達上調(diào)（q=4.655、5.408，P<0.05），10 μmol/L朝藿定B對LPS誘導的IL-6 mRNA表達有明顯的抑制作用（q=4.696，P<0.05）。朝藿定B對LPS誘導的TNF-α和IL-6 mRNA表達的抑制作用可被ICI 182，780所阻斷（F=12.53、28.71，q=5.318、4.684，P<0.05）。結(jié)論朝藿定B能夠抑制LPS誘導的BV2小膠質(zhì)細胞促炎因子的表達，其機制可能與ER信號途徑有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］朝藿定B；脂多糖類；炎癥；受體，雌激素；小神經(jīng)膠質(zhì)細胞

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0333-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.092［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230801.1834.004;2023-08-0211：03：43

ROLE AND MECHANISM OF EPIMEDIN B IN INFLAMMATORY RESPONSE IN BV2 MICROGLIA CELLS? HU Zifan， GU Yu， FAN Yuchen， DAI Wei， CHEN Wenfang （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Epimedin B on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in BV2 microglial cells and the blocking effect of the estrogen receptor （ER）-specific blocker ICI 182，780. MethodsBV2 microglial cells were routinely cultured and treated with or without Epimedin B， LPS， and ICI 182，780. MTT colorimetry was used to measure cell viability， and real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6）. ResultsDifferent concentrations of Epimedin B had no effect on the viability of BV2 microglial cells （P>0.05）. LPS significantly upregulated the mRNA expression levels of the proinflammatory factors TNF-α （F=10.64，q=9.157，P<0.001） and IL-6 （F=25.25，q=12.630，P<0.001）. Epimedin B pretreatment at concentrations of 1 and 10 μmol/L significantly inhibited the upregulated mRNA expression of TNF-α induced by LPS （q=4.655，5.408;P<0.05）， and Epimedin B at a concentration of 10 μmol/L significantly inhibited the LPS-induced mRNA expression of IL-6 （q=4.696，P<0.05）. The inhibitory effect of Epimedin B on the LPS-induced mRNA expression of TNF-α and IL-6 could be blocked by ICI 182，780 （F=12.53，28.71;q=5.318，4.684;P<0.05）. ConclusionEpimedin B can inhibit the expression of proinflammatory factors induced by LPS in BV2 microglial cells， which may be associated with the ER signaling pathway.

［KEY WORDS］Epimedin B; lipopolysaccharides; inflammation; receptors， estrogen; microglia

神經(jīng)炎癥是一種復雜的先天免疫反應，能夠?qū)Σ≡w、受損細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激物等有害刺激做出反應[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用，是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的主要驅(qū)動因素[2-4]。在各種致炎因子的刺激下，與神經(jīng)炎癥相關(guān)的小膠質(zhì)細胞被過度激活，釋放促炎因子，誘導神經(jīng)元損傷，使炎癥反應加劇，進而加速某些神經(jīng)退行性疾病的進程[5-7]。因此，有效抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的有益思路。淫羊藿作為傳統(tǒng)中藥，具有補腎壯骨、抗癌、抗抑郁、改善學習記憶等多種功效[8-10]。朝藿定B是淫羊藿總黃酮主要的活性成分，具有低毒的優(yōu)勢[11-12]。研究表明，朝藿定B具有調(diào)節(jié)炎癥和骨保護等作用，其機制可能與雌激素受體（ER）有關(guān)[13-14]。但在神經(jīng)系統(tǒng)，朝藿定B是否具有抗炎神經(jīng)保護作用尚未見報道。本研究應用脂多糖（LPS）制備BV2小膠質(zhì)細胞炎癥

334青島大學學報（醫(yī)學版）59卷

模型，探討朝藿定B對LPS誘導的BV2小膠質(zhì)細胞炎癥反應的作用及其可能機制。現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1主要材料

BV2小膠質(zhì)細胞屬于小鼠小膠質(zhì)瘤細胞系，購自北京市協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心；朝藿定B購自上海同田生物技術(shù)有限公司；LPS和ICI 182，780購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自BI公司；青霉素/鏈霉素儲存液購自新華制藥廠，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆茫惶ヅＱ遒徸訠I公司，分裝后-40 ℃保存?zhèn)溆茫?-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5二苯基溴化四唑（MTT）購自國風生物公司，應用濃度為0.01 mol/L的PBS溶解，配制成5 g/L的母液；TRIzol試劑購自美國Life Technologies公司；聚合酶鏈反應（PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國TaKaRa公司；SYBR Green（Master Mix）購自諾維贊醫(yī)療科技有限公司；PCR引物由青島蔚來生物科技有限公司設計并合成。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

BV2小膠質(zhì)細胞接種于培養(yǎng)瓶或孔板中，應用DMEM高糖培養(yǎng)液（內(nèi)含體積分數(shù)0.01的青鏈霉素和體積分數(shù)0.10的胎牛血清），置于無菌培養(yǎng)箱（含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃）中常規(guī)培養(yǎng)。

為觀察不同濃度朝藿定B對細胞活力的影響，實驗分為對照組、不同濃度（1、10、20 μmol/L）朝藿定B組、LPS（1 g/L）與不同濃度朝藿定B合用組。為觀察不同濃度朝藿定B對LPS誘導的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）mRNA表達的影響，實驗分為對照組（A組）、LPS組（B組）、1 μmol/L朝藿定B+LPS組（C組）、10 μmol/L朝藿定B+LPS組（D組）和20 μmol/L朝藿定B+LPS組（E組）。為驗證ICI 182，780是否能阻斷朝藿定B對LPS誘導的TNF-α和IL-6 mRNA表達的作用，實驗分為對照組（a組）、LPS組（b組）、朝藿定B+LPS組（c組）和ICI 182，780+朝藿定B+LPS組（d組）。

1.3MTT法檢測細胞活力

對BV2小膠質(zhì)細胞懸液進行計數(shù)，調(diào)整細胞的密度為8×107/L，隨后將細胞懸液均勻接種在96孔板中，每孔100 μL，置于含體積分數(shù)0.05 CO₂、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)至細胞融合度達到70%時，按照分組加入藥物處理24 h。棄去細胞培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L濃度的MTT溶液20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加100 μL二甲基亞砜，使甲瓚晶體溶解。在低速搖床（80～90 r/min）上避光振蕩10 min。最后用酶標儀在490 nm波長下檢測各孔吸光度（A）值。

1.4實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）方法檢測TNF-α和IL-6 mRNA的表達

在顯微鏡下觀察12孔板中的細胞融合度，達80％～90％時按分組進行加藥處理。收集細胞，應用TRIzol法提取細胞總RNA，按照TaKaRa試劑盒說明書配制兩步法反應體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20.0 μL的PCR反應體系，包括Master Mix 10.0 μL、RNase free water 8.2 μL、上下游引物各0.4 μL以及cDNA 1.0 μL。將此反應體系放入real-time PCR儀中進行擴增。經(jīng)40個循環(huán)完成擴增，采用2-△△CT法計算目的基因IL-6、TNF-α的相對表達量（以GAPDH為內(nèi)參基因）。PCR擴增引物及其序列見表1。

1.5統(tǒng)計學處理

應用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所得結(jié)果以±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），繼以Turkey法進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度朝藿定B對BV2小膠質(zhì)細胞活力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，對照組、不同濃度（1、10、20 μmol/L）朝藿定B組、LPS與不同濃度朝藿定B合用組的細胞存活率分別為1.000±0.035、1.006±0.025、1.014±0.024、0.984±0.032、1.006±0.036、1.021±0.034、0.999±0.032（n=3）。不同濃度朝藿定B對BV2小膠質(zhì)細胞活力沒有影響（P>0.05），表明實驗所選的用藥濃度對BV2小膠質(zhì)細胞沒有毒性。

2.2不同濃度朝藿定B對LPS誘導的TNF-α和IL-6 mRNA表達的影響

real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組BV2小膠質(zhì)細胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平顯著升高（F=10.64、25.25，q=9.157、12.630，P<0.001）；1、10 μmol/L朝藿定B預處理均能明顯抑制LPS誘導的TNF-α mRNA表達上調(diào)（q=4.655、5.408，P<0.05），10 μmol/L朝藿定B對LPS誘導的IL-6 mRNA表達有明顯的抑制作用（q=4.696，P<0.05）；1、20 μmol/L朝藿定B對LPS誘導的IL-6 mRNA表達有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。故選擇10 μmol/L的朝藿定B進行后續(xù)實驗。見表2。

2.3ICI 182，780對朝藿定B的阻斷效應

real-time PCR檢測結(jié)果顯示，朝藿定B對LPS誘導的炎癥反應的抑制作用可以被ICI 182，780所阻斷（F=12.53、28.71，q=5.318、4.684，P<0.05）。見表3。

3討論

ER分為核受體和膜受體兩大類，經(jīng)典ER即核受體包括ERα和ERβ，其表達具有組織和細胞特異性[15]。ER可由雌激素激活，被激活的ER發(fā)生易位，進而與靶DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因表達[16]。ER參與多個系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持，如生殖系統(tǒng)、大腦、心臟和肌肉骨骼系統(tǒng)等。除了核受體，以G-蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER）為代表的雌激素膜受體，可介導雌激素的快速非基因組效應，同樣在機體正常功能維持和疾病治療中發(fā)揮多種作用[17]。雌激素在相關(guān)疾病治療過程中會導致其受體過度表達，引起組織損傷，進一步誘發(fā)自身免疫性疾病和腫瘤等，嚴重影響疾病的治療和病人的身體健康[18]。因此，尋找補充或替代藥物對于治療相關(guān)疾病具有十分重要的意義。類雌激素是一種與雌激素結(jié)構(gòu)并不完全相同，但能發(fā)揮雌激素功能的物質(zhì)，二者的作用機制也并不完全相同。黃酮類化合物作為一種天然植物雌激素，具有類雌激素樣作用，可改善認知障礙，調(diào)節(jié)免疫炎癥[19-21]。在前期工作中我們鑒定了淫羊藿總黃酮指紋圖譜中的21個黃酮類化合物，證實了淫羊藿總黃酮及其含量最高的活性成分淫羊藿苷能夠?qū)股窠?jīng)毒素對多巴胺能神經(jīng)元的損傷[22]。研究表明，朝藿定B為含量第二高的單體成分，能夠提高骨肉瘤細胞（UMR-106）骨保護素mRNA的表達，發(fā)揮骨保護功能，其機制可能與ER有關(guān)[14]。近年來研究顯示，朝藿定B在MC3T3-E1細胞、潑尼松龍誘導的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型以及骨質(zhì)疏松小鼠模型中均表現(xiàn)出很好的骨保護作用[10，12，23]。但朝藿定B能否抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞的炎癥反應，其作用機制如何，目前尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，1、10 μmol/L的朝藿定B能夠?qū)筁PS誘導的細胞炎癥，10 μmol/L朝藿定B作用效果最明顯，能夠顯著下調(diào)促炎因子TNF-α和IL-6 mRNA的表達。1 μmol/L藥物濃度相對較低，并不能發(fā)揮良好的保護作用，20 μmol/L濃度相對較高，可能在一定程度上抑制了部分活性，導致保護效果有所降低。1、10 μmol/L濃度朝藿定B可顯著降低LPS誘導的TNF-α mRNA的表達升高，而10 μmol/L的朝藿定B對IL-6 mRNA的作用效果更好，這可能是因為不同因子對炎癥刺激的反應性有所不同，所以其mRNA的表達也會有一定差異。

我們最新的研究結(jié)果證實，朝藿定B能夠?qū)?-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶及其活性神經(jīng)毒性代謝物1-甲基-4-苯基吡啶誘導的多巴胺能神經(jīng)元損傷，GPER介導的信號途徑參與了朝藿定B的神經(jīng)保護作用[24]。而朝藿定B能否通過經(jīng)典ER基因組途徑發(fā)揮抗炎作用，有待進一步探討。本實驗應用ER特異性阻斷劑ICI 182，780預處理BV2小膠質(zhì)細胞，結(jié)果顯示朝藿定B的抗炎作用能夠被ICI 182，780所阻斷，提示ER核受體介導的信號途徑參與了朝藿定B的抗炎作用。

綜上所述，朝藿定B能夠抑制LPS誘導的BV2小膠質(zhì)細胞促炎因子的表達，其機制可能與ER信號途徑有關(guān)。

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（本文編輯馬偉平）