一種新合成吡啶類化合物對黑質多巴胺能神經元電活動的調制作用

王紫君　李昂　石麗敏

［摘要］目的研究一種新合成的吡啶類化合物對黑質多巴胺能神經元電活動的調制作用。方法應用全細胞膜片鉗技術觀察該化合物對黑質多巴胺能神經元自發放電頻率、誘發放電、內向整流（Sag）幅度等電活動相關指標的影響。結果C57/BL6小鼠黑質腦片灌流500 μmol/L化合物，多巴胺能神經元自發放電頻率明顯受到抑制（t=5.396，P＜0.05），0～40 pA的除極電流刺激后記錄的神經元誘發放電次數明顯減少；給予神經元40 pA的除極電流刺激，與基礎放電活動相比，峰電位間隔時間、動作電位的起始時間和時程均明顯增加（t=1.920～2.558，P＜0.05）；與基礎Sag幅度相比，-200 pA電流刺激后的Sag幅度明顯減小，差異具有統計學意義（t=3.149，P＜0.05）。結論此化合物能夠抑制正常C57/BL6小鼠黑質多巴胺能神經元的興奮性并降低Sag幅度，對神經元的電活動發揮調控作用。

［關鍵詞］帕金森病；電生理學；吡啶類；多巴胺能神經元；動作電位

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0341-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.085［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230731.1057.002.html;2023-07-3116：03：18

REGULATORY EFFECTS OF A NOVEL SYNTHESIZED PYRIDINE COMPOUND ON ELECTRICAL ACTIVITY OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIA NIGRA? WANG Zijun， LI Ang， SHI Limin （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the modulatory effects of a novel synthesized pyridine compound on the electrical activity of dopaminergic neurons in the substantia nigra. MethodsThe whole-cell patch clamp technique was used to record the changes induced by the compound in the electrical activity of substantia nigra dopaminergic neurons （spontaneous discharge frequency， evoked firing rate， and sag amplitude）. ResultsWith C57/BL6 mouse substantia nigra slices under perfusion with the compound at a concentration of 500 μmol/L， dopaminergic neurons spontaneous firing rate was significantly decreased （t=5.396，P<0.05）. The evoked firing rate was significantly reduced in response to depolarizing current pulses of 0-40 pA; in response to a depolarizing current pulse of 40 pA， the dopaminergic neurons interspike interval and action potential duration and initial time were significantly increased as compared with the baseline electrical activity （t=1.920-2.558，P<0.05）. In response to a current pulse of -200 pA， the dopaminergic neurons exhibited a significantly lowered sag amplitude compared with the baseline sag amplitude （t=3.149，P<0.05）. ConclusionThe novel synthesized compound could inhibit the excitability and decrease the sag amplitude of substantia nigra dopaminergic neurons in normal C57/BL6 mice， with a regulatory effect on the electrical activity of neurons.

［KEY WORDS］Parkinson disease; electrophysiology; pyridines; dopaminergic neurons; action potentials

帕金森病（PD）是以中腦黑質致密帶多巴胺（DA）能神經元變性、缺失為主要特征的慢性神經系統疾病，出現α-突觸核蛋白（α-syn）積聚沉淀以及紋狀體DA分泌減少等病理變化[1]。中國人口老齡化現象的日益加重導致PD的發病率逐年升高，嚴重影響了人們的生活質量。目前PD主要以左旋多巴類藥物干預治療為主，但長期服用該藥物會出現療效不穩定、發生胃腸道反應等副作用[2]。因此，尋求一種有效且副作用少的新型防治藥物成為PD治療領域的熱點研究問題。本實驗室前期工作觀察到，4-氨基吡啶（4-AP）對神經毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD模型障礙具有一定的改善作用[3-4]；WEI等合成的5種吡啶類衍生物，也具有良好的生物效應[5-6]。基于以上研究結果，本研究團隊與成都中醫藥大學開展合作，對新合成的19種吡啶類化合物進行生物學研究，初步證實12號化合物能誘導細胞自噬、減輕α-syn聚集，提示它在PD中具有潛在的保護作用。已知黑質DA能神經元具有自發放電活動，其生理功能的維持與神經元電活動密切相關，因此本實驗應用腦片膜片鉗技術，從電生理的角度探討12號化合物對DA能神經元電活動的調制作用，從而為PD的臨床治療提供潛在靶點。現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1動物及主要試劑

出生15～20 d的C57/BL6小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物的飼養及手術符合青島大學動物倫理學要求。實驗所用化合物由成都中醫藥大學合成提供，用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為200 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存，工作液濃度500 μmol/L。

1.2溶液配制

人工腦脊液（ACSF）的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L的KCl、2.4 mmol/L的CaCl2、1.3 mmol/L的MgCl2、1.3 mmol/L的NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、10.0 mmol/L Glucose混合，調整pH值為7.4（1 mol/L NaOH稀釋）、滲透壓為310 mOsm。低鈣切片液的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、0.5 mmol/L的CaCl2、1.0 mmol/L的MgCl2、1.3 mmol/L的NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、10.0 mmol/L Glucose混合，用1 mol/L NaOH 調節pH值至7.4，用滲透壓測量儀調節滲透壓至310 mOsm，并持續通體積分數0.05 CO2及體積分數0.95 O2的混合氣進行氧合（切片液需提前放入冰箱-80 ℃冷凍40 min成冰沙狀）。電極內液的配制：120.0 mmol/L K-gluconate、10.0 mmol/L的HEPES、10.0 mmol/L的EGTA、2.0 mmol/L的MgCl2、2.0 mmol/L的Na2ATP、0.3 mmol/L Na2GTP、20.0 mmol/L KCl混合，用1 mmol/L KOH調節pH值至7.3，將滲透壓調節至290 mOsm，-20 ℃保存分裝備用。

1.3離體黑質腦片制備

小鼠迅速斷頭取腦，置于4 ℃ ACSF中，1 min后將修剪好的腦切成250 μm厚的腦切片，放入連續通入體積分數0.95 O2及體積分數0.05 CO2混合氣體的ACSF中，孵育1 h，然后將腦片室溫下放置。隨機取其中1片進行腦片全細胞膜片鉗實驗，其余腦片放在ACSF中，用于后續實驗。

1.4腦片全細胞膜片鉗電生理學記錄

將離體腦片轉移至持續灌流ACSF（持續通入體積分數0.95 O2及體積分數0.05 CO2的混合氣體）的浴槽內，選擇健康、飽滿、邊界清晰的細胞進行全細胞膜片鉗記錄。將拋光的玻璃微電極注入合適體積的電極內液，直至電極尖端進入液面以下，使電極尖端慢慢接近細胞表面直至在細胞表面壓出類似“酒窩”的形狀，此時電流變小，電阻慢慢變大。迅速釋放正壓，快速達到千兆封接。如果電阻沒有達到千兆，則通過注射器給予細胞膜片一個負壓，使之達到千兆封接，并補償快電容。之后，采用負壓法吸破電極與細胞相接觸的膜片，使電極與細胞內液相通，并補償慢電容。轉換至電流鉗模式，將電流鉗置于0 pA，完成全細胞電流鉗模式記錄，判斷為黑質DA能神經元后，轉換至全細胞電壓鉗模式，將電壓鉗置于-70 mV，完成全細胞電壓鉗模式電流記錄。數據用Patch master軟件采集并儲存，用Minianaly-sis、Clamfit等軟件分析。

1.5統計學分析

應用SPSS 20.0和GraPhPad Prism 5 統計軟件進行處理，實驗結果以±s形式表示，配對樣本間比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1化合物對黑質DA能神經元自發放電頻率的影響

參考本實驗室之前的研究報道[7]，主要根據位置、形態、放電特征等指標鑒定DA能神經元：位于中腦腹側邊緣；細胞一般呈紡錘、三角或多極形，胞體較大，直徑大于25 μm；在電流鉗模式下，給予神經元-100 pA的超極化電流刺激后，神經元膜電位出現顯著的內向整流（Sag）特征；在全細胞模式下，神經元表現出頻率1～5 Hz的自發放電活動。

本實驗共記錄到了7個DA能神經元，其基礎自發放電頻率為（1.46±0.53）Hz，當灌流500 μmol/L的化合物10 min后，其放電頻率降低為（0.33±0.10）Hz，差異有顯著性（t=5.396，P＜0.05），延長至15 min后細胞的自發放電活動被完全抑制。

2.2化合物對黑質DA能神經元誘發放電活動的影響

在電流鉗模式下，給予DA能神經元0～40 pA的除極電流刺激后記錄誘發放電活動的相關指標。在記錄到的7個神經元中，隨著除極電流幅度的增加，動作電位爆發次數增多，以40 pA的除極電流刺激為例分析數據，在未灌流化合物前40 pA除極電流誘發的動作電位個數是3，當灌流500 μmol/L化合物后誘發動作電位個數為1，灌流后除極電流誘發的動作電位個數明顯減少。分析動作電位其他指標的變化情況結果顯示，灌流化合物后，峰電位間隔時間從（0.083 4±0.020 1）s增加至（0.110 6±0.017 2）s，動作電位時程從（0.998 0±0.415 7）s增加至（1.427 6±0.763 7）s，動作電位起始時間從（0.984 4±0.784 0）s增加至（2.911 8±0.255 1）s，差異均具有統計學意義（t=1.920～2.558，P＜0.05）。

2.3化合物對黑質DA能神經元Sag的影響

在電流鉗記錄模式下，給予一系列的超極化電流刺激（-200～0 pA，2 s）后，DA能神經元表現出顯著的Sag特征，即電位出現先快速超極化后除極，這種電位反轉的變化形成了典型的Sag。在灌流500 μmol/L化合物后再次給予相同的超極化電流刺激，每個電流刺激下的Sag幅度均明顯減小。以-200 pA 的超極化電流刺激為例，Sag幅度由灌流前的（47.29±11.33）mV 減少至灌流后的（30.27±13.31）mV，其差異具有統計學意義（t=3.149，P＜0.05）。

3討論

以往我們觀察到，4-AP對MPP+引起的DA能MES23.5細胞和原代培養的中腦腹側神經元的損傷有明顯的保護作用[3]，能夠有效改善MPTP誘導的PD小鼠的運動行為，如運動速度和運動平衡能力[4]。由WEI等合成的吡啶類衍生物被證實能夠在PD的體外模型中減少α-syn積累，減輕氧化應激損傷和炎癥，誘導Rho激酶激活[5-6]。此外有研究表明，4-AP類化合物還可以防止中樞神經系統的神經軸索損失，包括促進髓鞘再生、改善神經導電性和加速功能恢復等[8-9]；利用4-AP合成的熱凝膠聚合物能夠促進創傷性周圍神經損傷后的功能恢復[10]。以上研究均提示吡啶類化合物對于神經系統疾病具有一定的保護作用。本實驗主要觀察了新合成的化合物是否影響黑質DA能神經元的電活動，結果表明該化合物能顯著降低DA能神經元的自發及誘發放電頻率，并降低Sag幅度。

黑質DA能神經元在正常生理狀態下的電活動是維持其基本功能的關鍵，電活動紊亂是其發病機制的重要影響因素。黑質DA能神經元在全細胞電流鉗模式下主要表現為規則的緊張性放電，即起搏放電，少數細胞無自發放電[7]。對于緊張性放電的神經元，其動作電位頻率較低，本實驗記錄到的DA能神經元基礎放電頻率為1～2 Hz。DA能神經元的異常放電活動與PD的發病相關。α-syn沉積是PD病人的主要病理改變，在PD中黑質DA能神經元的缺損導致丘腦底核被過度激活，神經遞質谷氨酸過量累積[11]。此外，環境毒素也能夠增加谷氨酸的產生。過量的谷氨酸結合其受體（NMDA或者AMPA）并打開電壓門控鈣通道，引起Ca2+由細胞外大量內流，提高了DA能神經元內的Ca2+濃度，導致氧化應激和Ca2+興奮性毒性[12-13]。而興奮性毒性可能是DA能神經元的死亡機制之一[14-17]。本實驗觀察到，新合成的化合物能抑制神經元放電，提示該化合物在對抗興奮性毒性、平衡神經元電活動中起到調制作用。

該化合物通過何種機制影響神經元的電活動尚不清楚。本實驗觀察到，應用化合物處理細胞后，Sag的幅度明顯降低。Sag是黑質DA能神經元受到超極化電流刺激時，膜電位出現的先快速超極化再除極的電位反轉，一直被認為是DA能神經元的重要識別標志[18]，該特性由超極化激活的環核苷酸門控通道（HCN通道）介導[19-21]。HCN通道在調節神經元的興奮性、節律性以及突觸傳遞等活動中發揮著重要作用，應用HCN通道阻斷劑可以顯著減少神經元放電[22-27]。結合本文實驗結果，我們推測該化合物的作用靶點可能與HCN通道有關，通過抑制HCN通道，可降低神經元Sag幅度，減少自發及誘發放電活動。

綜上所述，本研究證實新合成化合物對黑質DA能神經元電活動有調制作用，這為論證該化合物在PD中的應用提供了新的實驗依據。

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（本文編輯馬偉平）