肺癌顱腦轉移動物模型建立的比較

涂洵崴 李鴻茹 陳正偉 王大璇

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其主要死亡原因是發生腦轉移。近年來，肺癌的發病率逐年升高，肺癌顱腦轉移的發病率也隨之升高。在臨床上有20%～30%的肺癌患者在確診時已經發生了顱腦轉移，40%～50%的肺癌患者在整個病程中會出現顱腦轉移。肺癌顱腦轉移導致患者預后不良、神經損害癥狀、生存質量下降、生存期減短，未經治療的中位生存期為1～3個月[1-3]。然而，目前對肺癌顱腦轉移發生的具體機制還不清楚，需要臨床相關的實驗動物模型來具體研究。本實驗通過比較不同注射途徑的方法建立肺癌顱腦轉移的實驗動物模型，即通過左心室注射、尾靜脈注射和胸腔注射具有顱腦轉移潛力的PC-9人肺腺癌細胞，以探究顱腦轉移動物模型建立的最佳注射途徑，為研究顱腦轉移的具體機制提供可靠的造模方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

BALB/c NUDE裸小鼠，雌性，體質量16～18 g/只，4～6周齡，健康，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2021-005]，隨機分配至左心室注射組、尾靜脈注射組、胸腔注射組，每組6只。通過剪裸鼠耳朵標記裸鼠的左耳上下、右耳上部位，為裸鼠編號。所用的飼料、水、墊料都經過嚴格滅菌處理，并按動物實驗的3R原則給予人道的關懷。RPMI 1640 培養基（HyClone公司，美國）、新生胎牛血清（杭州四季青生物技術公司，中國）、1%Pen-Strep雙抗（HyClone公司，美國）、0.25%胰酶-EDTA（Gibco公司，美國）、1 mL胰島素注射器（舒銳公司，美國）、生物安全柜（北京東聯哈爾、中國），CO2培養箱（上海力申科儀、中國）、倒置顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

PC-9細胞株，具有顱腦轉移潛能的人肺腺癌細胞系購買自中南大學湘雅醫學院實驗中心，以含體積分數為10%滅活新生胎牛血清、1% Pen-Strep雙抗、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養液培養，培養條件為37℃、5% CO2，并以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細胞懸液置備

當鏡下觀察細胞生長狀況良好時，取對數生長期的細胞，經胰酶消化制備細胞懸液，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入無血清的1640培養基，再經吹打、離心，以無血清培養基重懸制備單細胞懸液。

1.2.3 細胞計數

吹打混勻細胞，取4滴細胞懸液、4滴臺盼藍染液混于離心管中，活細胞不被染。將混勻的細胞懸液滴入細胞計數板中，統計四大格的活細胞及死細胞數，細胞量/mL＝（四大方格細胞總數/4）×104×2/mL。臺盼藍染色示細胞存活率＞90%（細胞存活率＝活細胞數/細胞總數×100%）。離心并重懸細胞至密度分別為1×107個/mL。

1.2.4 接種動物

左心室注射組：裸鼠麻醉、固定、消毒后，在胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進針。

尾靜脈注射組：裸鼠固定后，用酒精擦拭尾巴消毒并擴張血管，于尾部中外1/3處進針。

胸腔注射組：裸鼠右側臥位固定、消毒后，在腋后線第6肋間進針，以進針突破感后再進針3～4 mm為準。三組均注入0.1 mL（即1×106個腫瘤細胞）的PC-9細胞懸液。在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環境內飼養接種后的裸鼠。

1.2.5 標本留取

定期稱重，觀察裸鼠情況，注意裸鼠有無出現共濟失調、偏癱、跛行，當裸鼠出現惡病質，表現為弓背、消瘦、食欲減退時，處死裸鼠，解剖及HE染色觀察肺臟、顱腦。

1.3 觀察指標

1.3.1 裸鼠情況

記錄裸鼠體質量、觀察裸鼠一般情況以及注意有無共濟失調、偏癱、跛行。

1.3.2 形成肺部腫瘤及顱腦轉移情況

在無菌條件下解剖小鼠，觀察肺、腦臟器有無轉移灶，肉眼見病灶給予拍照記錄，取出肺組織、腦組織，以10%甲醛溶液固定，行常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察轉移情況。

2 結果

2.1 裸鼠情況

（1）左心室注射組：注射后18 d裸鼠開始出現體質量下降，惡病質逐漸出現，期間表現為共濟失調、偏癱、跛行的裸鼠有5只（圖1-A）。（2）尾靜脈注射組：注射后55 d裸鼠體質量開始減輕，92 d開始出現惡病質，期間均未出現共濟失調、偏癱、跛行。（3）胸腔注射組：注射后22 d，裸鼠出現胸壁瘤結；體質量在35 d開始下降，惡病質逐漸出現，期間均未出現共濟失調、偏癱、跛行。

圖1 裸鼠情況

2.2 形成肺部腫瘤及顱腦轉移

（1）左心室注射組：裸鼠27 d處死，肺（圖1-B）解剖觀察無異常，顱腦無異常；HE染色證實，6只裸鼠肺內腫瘤病灶均未檢出；轉移灶見所有裸鼠顱腦（圖1-C）。（2）尾靜脈注射組：裸鼠于112 d處死，解剖觀察肺（圖1-B）及顱腦無異常；HE染色證實4只裸鼠身上出現了肺部腫瘤灶；6只裸鼠均未發現顱腦轉移。（3）胸腔注射組：裸鼠于42 d處死，觀察肺及胸腔見多發腫瘤結節、團塊，并胸膜、肋骨、脊柱浸潤（圖1-D）；HE染色證實6只裸鼠均出現肺轉移灶；均未發現顱腦轉移。

3 討論

肺癌是常見的高發病率、高死亡率的惡性腫瘤[4]。大量患者死于晚期遠處轉移，尤其是腦部轉移[5]。顱腦轉移嚴重影響患者預后，故高效的顱腦轉移實驗動物模型對于肺癌顱腦轉移機制研究有重大意義。其他顱內轉移瘤主要來自乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤以及未知組織來源的腫瘤[6-8]。目前，國際上對顱腦轉移實驗動物模型的研究比較關注，國內外學者嘗試用各種不同的方法，包括尾靜脈注射、左心室或頸內動脈注射及腦立體定位原位種植途徑，相關的動物模型也已陸續被建立，然而均存在成功率不高或操作復雜的局限性[9-16]。因此，建立合適的實驗性動物模型，用于肺癌的顱腦轉移研究就成了重中之重。

課題組通過對比肺癌顱腦轉移的實驗動物模型，采用左心室注射、尾靜脈注射、胸腔注射的方法，發現左心室注射方法顱腦轉移形成率達到100%，而尾靜脈注射、胸腔注射的方法未發現腦轉移灶。查閱相關文獻，分析如下：左心室注射方法，心室解剖位置較易定位，技術難度較頸內動脈注射法降低，心室內血液容積大及被迅速泵入動脈，注射入的腫瘤細胞不易形成細胞團簇，有利于腫瘤細胞隨血液擴散；經左心室注射的腫瘤細胞，直接入動脈，能夠很快到達腦部毛細血管床，減少過程中被消滅的可利用的腫瘤細胞數，有助于顱腦轉移形成[17-21]。左心室注射的方法很好地模擬了肺癌的血行轉移，即通過肺微血管床的腫瘤細胞進入左心室，經血流流向腦部，產生腦轉移[22]。再則，左心室注射使腫瘤細胞滯留在肺微血管床的時間減少，腫瘤細胞經腦實質的數量增加，腫瘤細胞因肺癌而死亡的時間推遲，進而使腫瘤細胞在腦內生長和增殖的時間延長，從而獲得較高的腦轉移率；而尾靜脈注射、胸腔注射的方法，腫瘤細胞首先經靜脈滯留肺部，只有通過肺微血管床以及從肺轉移灶脫離的腫瘤細胞進入體循環，才能形成腦轉移可能。本實驗發現，尾靜脈注射組、胸腔注射組，裸鼠在顱腦轉移灶形成前，就因不堪肺臟及胸腔負瘤情況而出現惡病質死亡，且兩組中裸鼠生存周期相比較長，導致實驗周期延長。然而，左心室注射組裸鼠出現惡病質的時間明顯縮短，與臨床經驗相符，證明肺癌顱腦轉移嚴重縮短患者的生存周期。

此外，本實驗選擇的是具有肺癌顱腦轉移潛能的PC-9細胞株，腫瘤轉移模型的建立有賴于高致瘤能力的腫瘤細胞，研究結果表明只有少數腫瘤細胞能夠引起腫瘤發生、轉移，而大部分并不具備轉移、侵襲能力，且對于同一惡性腫瘤而言，其細胞的增殖、侵襲和轉移特性并不完全相同[23]。按照“種子與土壤”轉移學說的觀點，是腫瘤細胞異質性與靶器官微環境相互作用的結果，也就是說，腫瘤轉移具有器官特異性，不同的腫瘤具有對不同靶器官不同的親和性，從而形成進入動脈系統形成特定器官的腫瘤細胞轉移[24-25]。

關于左心室注射的方法：前期課題組先在小白鼠上實踐，考慮到與注射時間、接種細胞濃度（單細胞懸液1×108/mL）易栓塞有關，發現小白鼠有即時死亡或數小時或隔天死亡的現象；還有一些小白鼠在開胸后，考慮到注射時腫瘤細胞向胸腔或針管外漏可能，因此在胸腔內出現了微小種植灶的現象。所以總結左心室注射心得如下：（1）注射器：選擇BD牌1 mL胰島素注射器。（2）體位擺放：仰臥位固定，保證心臟體表位置處皮膚充分舒展；最好保證每只裸鼠仰臥位舒展的體外相對一致，以保證進針點的一致性。（3）進針前準備：進針前調節好BD針頭至滯留空氣0.05 mL后，再吸取細胞懸液0.1 mL。（4）進針點：仰臥位裸鼠胸前皮膚經酒精消毒后，可以清晰暴露裸鼠肋骨各位置；于胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進。（5）進針角度：針尖斜面朝向腳端，與地面成30°～45°角，注意緩慢進針。（6）進針：以突然見到血液噴射為標志，并在此時停止進針；并盡可能快速地推動注射器（10 s內），細胞懸液快推完時，及時拔出，以免注入空氣；如果一次嘗試未見血液噴射，重新改變進針點。目前，關于肺癌顱腦轉移的動物模型相對較少，大家都在探索階段，對細胞株和注射途徑的選擇未形成共識。本實驗選擇具有顱腦轉移潛能的人肺腺癌細胞株PC-9，采用左心室注射途徑，建立肺癌顱腦轉移模型具有明顯的高轉移率。

綜上所述，對于肺癌顱腦轉移實驗動物模型的建立，經左心室注射途徑，提供了一種可行的建模方法。