高效液相色譜法同時測定食品中的6 種人工合成色素

楊芩

（楚雄彝族自治州檢驗檢測認證院，云南 楚雄 675000）

0 引言

市場上琳瑯滿目的加工食品中現(xiàn)在使用的色素主要分為兩類，一類叫做天然色素，另一類叫做人工合成色素。天然色素被添加到食品中很安全的，但是在價格上又比較高，而且加工過程中也比較容易變色。但是顏色上來說，人工合成的比天然的鮮艷，也比天然的要穩(wěn)定，著色力更加強，價格也比它低，所以人工合成色素被廣泛應用于食品行業(yè)。人工合成的色素有著不同的化學結(jié)構(gòu)，可以分為3 類：三苯甲烷、非偶氮類和偶氮類[1]。社會在發(fā)展，人們對人工色素合成過程及結(jié)構(gòu)進一步了解，安全意識也在加強，國家對人工合成食用色素在食品中的添加進行嚴格的管控。可是因為它價格比較低而且性質(zhì)穩(wěn)定效果好，所以很多的人工合成食用色素超過國家限量標準，在市場上大量出現(xiàn)，嚴重危害人的健康，所以需要社會各個相關(guān)的部門加強對食品安全的監(jiān)督和管理，進一步提高檢驗檢測機構(gòu)的能力，開發(fā)出一種更便捷、更快速、更準確的檢測方法。

現(xiàn)在，國內(nèi)和國外用于檢測食品中的人工的合成色素的方法主要有電泳法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）、薄層色譜法（TLC）等。在國家標準《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中已經(jīng)明確規(guī)定各種常見色素的在各類食品中的使用范圍和它們的最大的使用限量，不同的色素可以添加在不同種類的食品中。以日落黃和檸檬黃為例，日落黃在飲料類的食品中的最大使用量是0.1g·kg-1，檸檬黃在糕點類、餅干中的最大使用量是0.05g·kg-1，日落黃與檸檬黃在糖果中的最大使用量是0.3g·kg-1[2]。還有很重要的一點就是在同一個食品中可能添加了不同的色素，它們不僅各自的使用不能超出國標規(guī)定的限汁，而且?guī)追N色素的最大使用量比例之和必須要小于1，除了國家標準中規(guī)定的色素以外，其他的那些色素都不能用于食品中。我們國家食品中的人工合成色素主要以高效液相色譜法（HPLC）作為檢測方法。隨著檢驗方法的不斷改進，食品中的人工合成色素檢測也變得更加精準起來了。HPLC 是一種現(xiàn)在最常用的合成色素檢測方法，國內(nèi)外的研究也比較多，檢測的樣品種類夜越來越豐富。從最開始的果蔬汁飲料里面的合成色素檢測，到了后面的像蛋白飲料、肉類等含較多蛋白質(zhì)的食品中合成色素的檢測，HPLC 法對于食品中合成色素檢測的準確性和精確性更高了。HPLC 法的原理是以高壓下的也作為流動相，樣品溶液通過色譜柱進行分離以后，再經(jīng)過檢測器對各種樣品中的人工合成色素的種類和含量等進行檢測，從而完成對該樣品的檢測分析，具有操作簡便，選擇性和準確性高，分離效果好的特點。

本文通過HPLC 法擬研究出一種能夠同時檢測出常見的6 種人工合成的色素的實驗條件，建立一種能夠同時檢測食品中的合成色素檸檬黃、莧菜紅、亮藍、胭脂紅、日落黃和誘惑紅的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC-20A 型日本島津的高效液相色譜儀（LC-solution型化學工作站、CBM-20A 型系統(tǒng)控制器、LC-20AB 型輸液泵、SPD-M20A 型二極管陣列檢測器、SIL-20AC 型自動進樣器、CTO-20AC 型柱溫箱）、梅特勒ME204E/02 型分析天平、HH-2 電熱恒溫水浴鍋、KH19A 型離心機、SB25-12DT 型超聲波清洗器、SYNS0000 型純水機。

1.1.2 試劑

日落黃標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）、檸檬黃標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）、胭脂紅標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）、莧菜紅標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）、亮藍標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）、誘惑紅標準溶液（濃度均為0.500mg·mL-1，購自中國計量科學研究院）。

甲醇（色譜純，美國MREDA）、甲酸（色譜純，美國MREDA）、無水乙醇（色譜純，美國MREDA）；氨水（分析純，重慶川東化工有限公司）、乙酸銨（分析純，成都艾科達化學試劑有限公司）、檸檬酸（分析純，重慶川東化工有限公司）。

試驗用水均為超純水一級，樣品為市售飲料、糖果、配制酒等。

乙酸銨（0.02mol·L-1）溶液。稱取1.54g 的乙酸銨，加水定容至1000ml 溶解，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）過濾。

氨水溶液。用量筒量取氨水4～200mL 容量瓶，純水定容至刻度后混勻。

甲醇-甲酸（6+4）混合溶液。用量筒量甲醇120mL，甲酸80mL，混合均勻。

檸檬酸溶液。稱取20g 檸檬酸至小燒杯，溶解后轉(zhuǎn)移到100mL 容量瓶，純水定容至刻度后混勻。

氨水-無水乙醇-水溶液（2+7+1）。用量筒量取無水乙醇140mL、氨水40mL、純水20mL，混合均勻。

1.2 樣品處理

1.2.1 液體樣品處理

稱取20g（精確至0.0001g）至100mL 燒杯，超聲驅(qū)除碳酸飲料中的二氧化碳，水浴加熱驅(qū)除配制酒中的乙醇，乳飲料先離心沉淀，再加蛋白沉淀劑，用調(diào)pH 到6 左右（用檸檬酸溶液調(diào)）[3]。

1.2.2 固體樣品處理

稱取5g（精確至0.0001g）至100mL 燒杯，糖果、蜜餞等溫水溶解后用檸檬酸調(diào)pH 至6 左右，巧克力豆用水反復洗滌合并漂洗液[4-5]。含脂肪較多的樣品，比如肉制品，粉碎混勻后先用石油醚將脂肪洗掉，再用乙醇-氨水混合液提取樣品中的人工合成色素，最后調(diào)節(jié)pH至6 左右；糕點類食品的檢測是用乙醇-氨水混合液提取的色素，并利用超聲提取對樣品進行處理20min，最后用甲醇多次洗滌合并提取液。

1.2.3 聚酰胺吸附法提取色譜

前面步驟處理的樣品溶液調(diào)節(jié)pH 約6 左右（加檸檬酸溶液調(diào)），加熱到60℃，加入1g 左右的聚酰胺粉調(diào)糊狀，再用G3 漏斗抽濾，用pH 約4 的純水（60℃）來洗滌5 次，接著用甲醇-甲酸溶液再來洗滌5 次，然后用純水洗至中性，后用乙醇-氨水-水混合液解吸5 次，收集溶液之后調(diào)至中性（用乙酸溶液調(diào)），蒸至近干，加純水定容到5mL。過微孔濾膜（0.45μm），備用。

1.3 色譜條件

流動相為0.02mol·L-1的乙酸銨和甲醇，梯度洗脫，柱溫35℃，流速均為1.0mL·min-1，進樣量為10μL，紫外檢測的波長為254nm，ODS-C18 型色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），實驗完成之后根據(jù)以紫外吸收譜圖的峰保留時間定性，外標法峰面積定量。

1.4 標準曲線

用純水將各標準儲備液配制成不同濃度的混合標準工作液，其濃度分別為5.0μg·mL-1、10.0μg·mL-1、25.0μg·mL-1、35.0μg·mL-1、50.0μg·mL-1，進樣體積為10μL，用各組分的標液濃度和峰面積做出標準曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的測定

分別取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍濃度為25.0μg·mL-1的標液，在160～410nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示6 種合成色素在254nm 波長處都有較強吸收，所以我們選擇254nm 的檢測波長。

2.2 流動相選擇

本文選擇甲醇和0.02mol·L-1乙酸銨溶液為流動相，梯度洗脫，25min 內(nèi)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍這幾種合成色素組分已經(jīng)完全分離，而且分離度較高。液相色譜條件中的梯度洗脫流動相變化如表1 所示。

表1 液相色譜條件中的梯度洗脫流動相變化

2.3 流動相pH 的選擇

本實驗選擇了pH 為4、5、6、7、8 的五種流動相，結(jié)果表明流動相pH 為5 時分離效果較好，6 種色素峰分離度好，出峰順序依次為：檸檬黃6.818min，莧菜紅7.596min，胭脂紅9.273min，日落黃10.360min，誘惑紅11.541min，亮藍13.320min，標樣色譜圖如圖1 所示。

圖1 6 種色素的標準譜圖

2.4 標準曲線和線性關(guān)系

本實驗是用6 種色素各個組分的質(zhì)量濃度（μg/mL）為縱坐標，以對應的峰面積為橫坐標進行線性回歸做的標準曲線（圖2）。本文實驗中所得檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍組分的保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)如表2 所示。

圖2 標準曲線

表2 回歸曲線的基本參數(shù)

2.5 回收率及精密度

用未加色素的樣品進行回收率實驗，添加水平分別為5mg·kg-1，測定3 次，測定結(jié)果表明被測樣品的加標回收率為92.8%～98.7%，相對標準偏差（RSD）為1.2%～1.8%，測定結(jié)果可靠。樣品回收率和及精密度試驗如表3 所示。

表3 樣品回收率和精密度試驗

3 結(jié)論

目前一些廠家在很多食品中都添加了各種各樣的色素，這樣做看上去就增強了人的食欲，讓人想去購買品嘗，所以色素經(jīng)常被用到食品加工行業(yè)中。還有一些廠家因為產(chǎn)品的新鮮程度不夠，為了不被發(fā)現(xiàn)，就會違規(guī)或者超量使用色素。如果我們經(jīng)常食用這些過量色素的食物，身體就會有影響，甚至是致癌。

本實驗研究用HPLC 法能夠更加準確、更加快速地同時檢測出食品中的6 種人工合成的色素，并且能夠達到各個色素的組分最好分離效果的實驗條件。具有圖譜組分分離度好、靈敏度高以及重現(xiàn)性強的優(yōu)點，在實際工作中實用價值較高，可用于食品中人工合成色素的測定。通過這種方法來檢測或控制食品中人工合成色素的含量，從而才能更好地保證食品安全。