抗PDL1-CAR慢病毒載體的構建及其轉染培養體系的優化*

彭群藝，李純團，鄭艷，朱雄鵬

362000福建 泉州，福建醫科大學附屬泉州市第一醫院 血液科

近年來，將嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）與T細胞結合的一種T細胞技術應用于腫瘤免疫治療中已成為學術研究的主要焦點［1-2］。通過基因修飾使T細胞表達CAR，從而針對靶細胞進行直接識別和殺傷，這項技術在血液腫瘤治療中取得了顯著效果［3-5］。

CART細胞治療常用的轉染方法有三種：電穿孔、基于質粒的轉座子/轉座酶基因傳遞和慢病毒轉染［6］。電穿孔法效率最差；基于質粒的轉座子/轉座酶基因傳遞法成本低，轉染效率僅次于慢病毒法［7］；慢病毒轉染效果最佳，但成本高［8］。

由于構建不同CAR載體，轉染和培養方式的不同，以及細胞株等因素影響，導致每一次轉染，轉染效率差異較大，對CART細胞功能研究造成嚴重的影響。故本研究擬構建一種靶向程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）的CAR慢病毒載體（抗PDL1-CAR），并采用非磁珠法進行轉染和擴增培養，并利用不同的病毒感染復數（multiplicity of infection， MOI）對T細胞進行轉染，保證抗PDL1-CAR慢病毒轉染效率，從而優化CART細胞最佳的轉染條件與培養方式，為CART細胞的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人伯基特淋巴瘤CA46細胞株由福建省血液病研究所提供。本課題組在前期研究中，已將CD274基因慢病毒轉導到CA46細胞中得以產生表達PD L1和mCherry熒光蛋白的PDL1-CA46細胞，并使用含有5 mg/mL嘌呤霉素的10%胎牛白清培養基培養。293T細胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司）為慢病毒的包裝細胞，按5×105個/mL的細胞密度接種于10 cm的培養皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養基培養。

1.2 工具載體酶切

帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP） 的質粒GV401（購自上海吉凱基因科技有限公司）結構圖見圖1A，構建 50 μL酶切體系：ddH2O 43μL，CutSmart Buffer 2.5μL，質粒 DNA3μL，BamH I 1.5μL，混勻，37℃反應 3 h。反應后將產物電泳并回收目的條帶。

圖1 抗PDL1-CAR載體的設計與鑒定Figure 1.Design and Identification of the Anti-PDL1-CAR Vectors

1.3 獲取與擴增抗PDL1-CAR基因片段

設計抗PDL1-CAR基因引物：上游5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3’，下游3’-ATAAGCTTGATATCGAATTCTTAAACAACAGAGAAACGGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCG-5’。建立PCR體系：5×PS Buffer 10μL， 上下游引物（10μM）各1μL，dNTP Mix 4μL， Prime STAR HS DNA 聚合酶 0.5μL，抗PDL1-CAR基因（上海生工合成）樣本1μL，ddH2O 32.5μL，共50μL。PCR循環條件：98℃加熱5 min；98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 90 s，30個循環；72℃延伸8 min，4℃保溫。PCR基因擴增產物進行凝膠電泳檢測，110 V，電泳0.5 h。

1.4 抗PDL1-CAR基因PCR擴增產物與載體重組和轉化

于冰浴中配制反應體系，樣本組：ddH2O 3.5μL，5×CE II 緩沖液 2μL，酶切后載體DNA 2.5μL，抗PDL1-CAR基因PCR擴增產物 1μL，Exnase TM II 1μL，共10μL。GAPDH對照組：ddH2O 2.5μL，5×CE II緩沖液 2μL，酶切后的載體 DNA 2.5μL，GAPDH基因2μL，Exnase TM II 1μL，共10μL。混勻后37℃30 min，再冰浴 5 min 后立即轉化。將 5μL轉化產物與100 μL感受態混勻，冰上放置 30 min。 42℃熱激 90 s，冰育 5 min。再加入 450 μL LB 培養基，37℃搖床振蕩培養1 h。混合液均勻涂在平板上，倒置培養于37℃恒溫培養箱中12～16 h。 轉化后的樣本送往上海生工進行測序，測序結果用基因比對軟件DNA-MAN進行分析比對。最后將測序陽性的樣本提取質粒。

1.5 轉化子PCR產物鑒定

目的基因引物：上游5’-CCACCCAATGCTAATGAAG-3’，下游3’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-5’。建立反應體系：ddH2O 8.2μL，轉化后陽性樣本1μL，2× Taq Plus Master Mix 10μL，上下游引物（10 μM）各0.4μL，共20μL。PCR循環條件：95℃加熱3 min，1個循環；95℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，32個循環；72℃延伸5 min，4℃保溫。PCR擴增基因產物的凝膠電泳檢測：制2%濃度的瓊脂糖凝膠，取5μL的PCR產物，與1μL的EB混合后加入凝膠孔中，110 V，電泳0.5 h。

1.6 慢病毒的包裝與濃縮

配制體系： pHelper 1.0質粒 15 μg，GV401質粒20 μg， pHelper 2.0 質粒10 μg，Lipo3000 22.5μL，用Opti-MEM將體積調整為 1 mL，加入293T細胞當中，培養6 h后更換含 10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃培養48 h。收集293T細胞的上清液，過濾后25 000 rpm 4℃離心2.5 h，棄上清，加入200 μL的DMEM培養基，于-80℃保存備用。慢病毒滴度檢測由上海吉凱基因科技有限公司通過qPCR絕對定量法和熒光法檢測完成，病毒滴度為2.07×105TU/μL。

1.7 抗PDL1-CAR細胞的轉染與培養

采用非磁珠法，每次收集50～100 mL健康志愿者的外周血，并同時告知和簽署科研知情同意書。通過連續密度梯度離心法從外周血中分離單個核細胞，在包被有抗CD3mAb和抗CD28mAb的6孔板中培養，加入IL-2（20 U/mL）。第2天， 取2 × 105個/孔的淋巴細胞于24孔培養板中，每孔體積為200 μL，按MOI= 10、20、40分別加入抗PDL1-CAR病毒載體10μL、20μL、40μL于24孔培養板中，IL-2（30 IU /mL），Histrnas P 10μL，transA 20μL。第4天， 去上清更換新鮮1640培養基，加IL-2（200 U/mL）。第8天，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況，流式檢測抗PDL1-CAR細胞的陽性率。并用Flowjo軟件對數據結果進行分析。

1.8 細胞毒性試驗

按MOI = 20的條件轉染和培養效應細胞，每孔取5×104個表達mCherry熒光的PDL1-CA46于24孔板中，按1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的效靶比加入相應的效應細胞（CART細胞和T細胞）進行混合共培養，每組重復3次。培養16 h后，先通過JIMBIO FIL檢測細胞總數，再加入AnnexinV 5μL，流式檢測儀檢測0 h和16 h PDL1-CA46細胞百分率（Annexin V陰性mCherry陽性）。殺傷率% = （1-細胞總數×16 h PDL1-CA46細胞百分率/細胞總數×0 h PDL1-CA46細胞百分率）100%。

1.9 統計學方法

使用SPSS 17.0軟件分析兩獨立樣本均數，采用 MannWhitney U檢驗比較兩組間差異，P ＜ 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 抗PDL1-CAR載體的構建

GV401載體經酶切后電泳顯示PCR產物分子量約為10kb（圖1B）。抗PDL1-CAR目的基因片段經電泳后顯示條帶的分子量為1.5 kb（圖1C）。與線性表達載體進行重組和轉化后，含有目的基因片段的轉化子PCR產物大小為1 kb（圖1D），構建出的慢病毒載體經上海生工基因測序比對，與MEDI4736序列一致。

2.2 抗PDL1-CAR載體的結構

抗PDL1-CAR載體結構的胞外段是信號肽和抗PD-L1 單鏈抗體可變區片段，單鏈抗體可變區片段可結合腫瘤細胞表達的PD-L1，該片段是源自于MEDI4736的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL序列，跨膜區序列是CD8鉸鏈，胞內段由4-1BB和CD3ζ信號區組成，EGFP連接于信號區末端（圖2A、2B）。構建的抗PDL1-CAR載體轉染293T細胞72 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到表達綠色熒光的細胞（圖2C）。

圖2 抗PDL1-CAR的構建與表達Figure 2.Construction and Expression of Anti-PDL1-CAR

2.3 抗PDL1-CAR細胞的表達

淋巴細胞在活化后按MOI = 10、 20、 40的條件加入抗PDL1-CAR病毒，培養第8天進行流式檢測，各組CART細胞陽性表達率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%（圖3A、B）。通過熒光顯微鏡檢測，可觀察到表達出綠色熒光的CART細胞（圖3C）。

圖3 抗PDL1-CAR不同MOI下的轉染效率Figure 3.Efficiency of Anti-PDL1-CART Cells with Different MOI

2.4 抗PDL1-CAR細胞殺傷性檢測

將PDL1-CA46腫瘤細胞按不同的效靶比與效應細胞共培養16 h，在1∶1效靶比時，CART細胞和T細胞兩者對PDL1-CA46細胞殺傷率差異無統計學意義（Z = -0.218， P = 0.827）。在2∶1、5∶1和10∶1效靶比時，CART 細胞對PDL1-CA46細胞殺傷率顯著高于T細胞，差異具有統計學意義（Z = -1.964， P ＜ 0.05），且效靶比越高殺傷活性越強（圖4A），殘留的PDL1-CA46細胞越少（圖4B）。

圖4 抗PDL1-CART細胞的體外殺傷檢測Figure 4.Cytotoxicity of Anti-PDL1-CART Cells in Vitro

3 討 論

CART細胞利用胞外的嵌合受體與靶細胞結合，可以不受主要組織相容性復合體限制，直接激活T細胞，從而對靶細胞產生免疫應答［9-10］。盡管CART細胞治療在臨床上已取得了一定的突破，但是CART細胞的構建及其轉染培養仍然是影響CART細胞免疫治療的關鍵因素之一［11-13］。

本次研究構建了一種新的抗PDL1-CAR慢病毒載體，其主要結構由抗PDL1 scFv（胞外段）和胞內的信號區（4-1BB和CD3ζ）組成，信號區末端協同表達一個EGFP，以便于在流式細胞儀和熒光顯微鏡下監測抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉染情況［14-15］。

在慢病毒轉錄過程中，常常會由于構建的載體不同，實驗條件的差異，每一次構建的慢病毒載體滴度不同和細胞株的差異等因素，導致每一次轉染后CART細胞的表達率也不相同，從而對接下來的CART功能研究產生許多不利的影響［16］。本課題組通過qPCR技術檢測抗PDL1-CAR慢病毒載體滴度，利用3種不同的MOI進行抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉染，通過流式和熒光顯微鏡檢測轉染后抗PDL1-CAR細胞的表達率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%，每組MOI樣本都重復3次，重復誤差很小，從圖3結果可以看出MOI = 20或者40的轉染效率大于30%，在越高的效靶比下，CART細胞對PDL1-CA46細胞殺傷性越高，完全滿足后續CART細胞的功能研究，而且不用擔心重復轉染造成轉染效率結果的差異性。

CART細胞只有體外擴增培養出足夠數量的效應細胞，才有利于CART細胞功能研究和體內回輸治療，目前最常用的CART細胞體外培養方式是磁珠刺激培養，Davila等［17］在研究中采用CD3/CD28磁珠刺激培養CD19-CART細胞，轉染效率達38.4%。通過加入CD3/CD28磁珠反復刺激培養可以將細胞體外培養超過60天，且擴增數量達到109～1011［18］。采用磁珠方法效果雖好，但磁珠和相應設備昂貴，成本高，操作復雜。非磁珠法CART細胞體外擴增培養往往是通過培養瓶中包被抗CD3和CD28抗體來刺激細胞，并加入細胞因子進行擴增培養，Gargett 等［19］研究發現，CD3/Retronectin/IL-2激活擴增的GD1-iCART細胞低于CD3/CD28/IL-7/IL-15和CD3/CD28/IL-2，培養10～14天后細胞數量可擴增至106～107。本次研究采用非磁珠法對CART細胞進行擴增培養，并對此進行優化，培養出的抗PDL1-CAR細胞數量完全滿足后續實驗的需要，并且對表達PD-L1的血液腫瘤細胞CA46具有很強的殺傷性［20］。轉染效率高，且成本相對磁珠法低，操作簡單，但體外細胞培養觀察中發現細胞活性持續時間不長，無法超過21天。

總之，本研究進一步探索了CART細胞的結構和功能，為CART細胞的構建提供良好參考，同時優化CART細胞的轉染條件和培養方法，增加CART細胞的表達率和殺傷活性，為CART細胞的功能研究提供了基礎。

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