右美托咪定調節miR-711/GDNF信號軸對創傷性腦損傷大鼠認知障礙和神經損傷的影響

汪暉

摘要：目的：探究右美托咪定（Dex）是否能夠通過調節miR-711/膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）信號軸改善創傷性腦損傷（TBI）大鼠認知障礙和神經損傷。方法：將大鼠按照隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、TBI組、Dex組、miR-NC組、miR-711 agomir組、miR-711 antagomir組，每組10只。采用腦損傷打擊器自由落體打擊，建立TBI大鼠模型。結論：Dex可能通過調控miR-711/GDNF信號軸減輕海馬組織病理損傷，抑制促神經元凋亡蛋白的表達，改善TBI后認知障礙和神經損傷，發揮腦保護作用。

關鍵詞：右美托咪定；miR-711；膠質細胞源性神經營養因子；創傷性腦損傷；認知障礙；神經損傷

中圖分類號：R96 ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ?文章編號：1008-4657（2023）04-0008-08

0 ? ? ? ?引言

創傷性腦損傷（traumatic ?brain injury， TBI）是臨床腦外科常見的中樞神經系統損傷性疾病，是由于直接或間接暴力損傷腦部所致，具有較高的致死率、致殘率［ 1 ］，嚴重影響人類的生命健康。研究發現，交通事故頻發是導致TBI發生率逐漸增加的主要原因，其導致的神經功能障礙與認知功能障礙為患者生活以及家庭都造成沉重的負擔［ 2 ］。TBI主要分為原發性和繼發性損傷，原發性損傷不可逆，可直接引起死亡［ 3 ］；繼發性損傷的發生機制復雜，與氧化應激、炎癥反應以及神經元凋亡等多種病理活動有關［ 4 ］，最終引起神經功能障礙與認知障礙［ 5 ］。因其發生機制尚不清晰，臨床上用于TBI后神經保護藥物較少，尋找及時有效的神經元修復手段與治療方法是目前TBI的研究熱點。

右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一種高選擇性中樞神經α2腎上腺素受體激活劑，廣泛用于手術中的鎮靜止痛，具有抗氧化應激、改善炎癥反應、減少細胞凋亡等作用［ 6-7 ］。大量研究證實，Dex在腦缺血再灌注、缺血缺氧以及腦出血等腦損傷中能夠有效發揮神經保護作用［ 8-9 ］。研究發現，Dex能夠通過減輕腦水腫、減少神經元凋亡、抑制自噬，改善TBI大鼠學習與記憶功能障礙，發揮腦保護作用［ 10 ］。近年來，微小RNA（miRNA）在腦損傷發生發展中的研究迅速發展，并受到廣泛關注。研究發現，Dex通過調控miR-129-5p對新生小鼠缺血缺氧性腦損傷治療效果顯著［ 11 ］。TBI后miR-711水平顯著上調，引起神經元凋亡蛋白異常表達，導致神經元死亡［ 12 ］。

膠質細胞源性神經營養因子（glial ?cell line-derived ?neurotrophic ?factor， GDNF）是一類多巴胺能神經營養因子，能夠保護多種神經元損傷［ 13 ］。采用生物信息學網站預測可知，GDNF的3UTR上具有miR-711的結合位點，猜測GDNF可能是miR-711的靶基因。本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證GDNF與miR-711的靶向關系，并建立TBI大鼠模型，探究Dex是否能夠通過調節miR-711/GDNF信號軸，改善TBI后大鼠認知障礙，保護神經損傷。

1 ? ? ? 材料

1.1 ? ? ? ?實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，8周齡，體質量為200～220 g，購自中國醫學科學院醫學生物學研究所，動物生產許可證號為SCXK（滇）K2019-0002。實驗前適應性飼養一周，飼養條件為：溫度22～25℃，濕度45%～55%，晝夜時長12 h：12 h，期間不控制飲水和采食。實驗過程嚴格按照實驗動物管理條例進行，符合“3R”原則。

1.2 ? ? ? ?實驗藥物與試劑

Dex（SC13911）購自北京凱詩源生物科技有限公司；miR-711激動劑（miR-711 agomir）、miR-711抑制劑（miR-711 antagomir）及陰性對照物均購自廣州銳博生物科技公司；HE染色試劑盒（R3209）購自北京康瑞納生物科技有限公司；TRIzol試劑盒（CD-13433-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒（MQ101-01/02）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA裂解液（R0010）、BCA蛋白檢測試劑盒（PC0020）、ECL發光液（PE0010）均購自北京索萊寶生物技術有限公司；GDNF抗體（ab28956）、Bcl-2抗體（ab196495）、Bax抗體（ab32503）、GAPDH抗體（ab181603）、山羊抗兔二抗（ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.3 ? ? ? ?實驗儀器

ZH-ZYQ腦損傷打擊器購自安徽正華生物儀器設備有限公司；Morris水迷宮裝置購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；NB2000生物顯微鏡購自南京先納光學儀器有限公司；RTQ-960 Pro實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀購自杭州艾康生物技術有限公司；Miulab GIS-500凝膠成像分析系統購自杭州米歐儀器有限公司。

2 ? ? ? 方法

2.1 ? ? ? ?模型建立

將大鼠按照隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、TBI組、Dex組、miR-NC組、miR-711 agomir組、miR-711 antagomir組，每組10只。除Sham組外，其余組參考文獻［ 14 ］采用腦損傷打擊器自由落體打擊，建立TBI大鼠模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，仰臥位固定于打擊器上，頭部消毒備皮，于顱骨正中開約3 cm長的切口，分離軟組織暴露顱骨；于矢狀縫正中，人字縫和冠狀縫連接線中點的右3 mm處鉆孔，注意保持硬腦膜完好；將打擊墊放置在暴露的硬腦膜上，進行打擊；之后進行止血消毒、逐層縫合頭皮。Sham組10只大鼠僅開窗，不做撞擊處理。

2.2 ? ? ? 給藥方法

參照文獻［ 15 ］，Dex組、miR-NC組、miR-711 agomir組、miR-711 antagomir組分別于造模前10 min腹腔注射Dex 100 μg/kg。造模結束后miR-NC組、miR-711 agomir組、miR-711 antagomir組立即進行對側側腦室miR-NC、miR-711 agomir和miR-711 antagomir的注射，每次1 nmol，注射5 μL。Sham組與TBI組給予等體積生理鹽水進行注射。

2.3 ? ? ? ?Morris水迷宮實驗評價各組大鼠認知功能

給藥結束后48 h，參考文獻［ 16 ］采用Morris水迷宮測試評價各組大鼠認知功能：放置水池，保持溫度為22～25℃，注水后將水池平均分為四個象限，其中一個象限設置平臺，訓練大鼠找到平臺，記錄所需時間，每日進行4次實驗，間隔15 s，訓練4 d后，移除平臺，記錄逃逸潛伏期與經過原平臺象限次數。

2.4 ? ? ? ?神經功能評分［ 14 ］

神經行為學評分：姿勢異常（0～2分）、耳廓反射（0～1分）、角膜反射（0～1分）、立體感受檢測（0～1分）、放置反射（0～4分）、翻正反射（0～3分）、抓握反射（0～4分），總分16分，評分越低提示行為學異常；運動功能評分：行走試驗（0～3分）、平衡試驗（0～6分）、爬坡試驗（0～2分），總分11分，評分越低提示運動功能異常。

2.5 ? ? ? ?HE染色觀察各組大鼠海馬組織病理學變化

麻醉并斷頸處死大鼠，分離海馬組織，部分組織置于多聚甲醛中固定，制備常規石蠟切片，隨后采用常規二甲苯、酒精脫蠟處理，HE染色，封片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠海馬組織病理學變化。

2.6 ? ? ? ?qRT-PCR檢測各組大鼠海馬組織中miR-711、GDNF mRNA表達

采用TRIzol試劑盒提取海馬組織總RNA，反轉錄合成cDNA。按照qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒說明書進行操作，采用qRT-PCR儀進行熒光定量PCR擴增。擴增條件為95℃預變性3 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法，以U6、GAPDH為內參，計算miR-711、GDNF mRNA相對表達量。qRT-PCR所需引物序列見表1。

2.7 ? ?雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-711與GDNF的靶向關系

應用TargetScan生物信息學預測網站（http：//www.targetscan.org/）預測發現，miR-711與GDNF具有潛在結合位點。采用雙熒光素酶報告基因系統確定兩者之間的靶向關系：將構建好的GDNF野生型質粒（GDNF-WT）與GDNF突變型質粒（GDNF-MUT）分別與NC mimics和miR-711 mimics共轉染至HEK293T細胞（中科院細胞庫提供）中，分別為miR-NC組、miR-711組。培養48 h后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組螢火蟲熒光素酶活性（Fluc）和海腎熒光素酶活性（Rluc），以Fluc/Rluc表示相對熒光素酶活性。

2.8 ? Western Blot法檢測各組大鼠海馬組織GDNF以及神經元凋亡相關蛋白的表達

海馬組織中加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白含量；取40 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，TBST洗膜，加入GDNF、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL顯影，凝膠成像分析系統分析灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

2.9 ? 統計學方法

實驗數據采用SPSS22.0統計學軟件進行分析，計量資料符合正態分布，以（ ± s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 ? 結果

3.1 ? Dex對TBI大鼠認知功能的影響

與Sham組比較，TBI組大鼠逃逸潛伏期明顯延長，經過原平臺象限次數顯著減少（P ＜ 0.05）；Dex組大鼠逃逸潛伏期較TBI組顯著縮短，經過原平臺象限次數顯著增加（P ＜ 0.05）；與Dex組比較，miR-NC組大鼠逃逸潛伏期與經過原平臺象限次數無顯著差異（P ＞ 0.05）；與miR-NC組比較，miR-711 agomir組大鼠逃逸潛伏期明顯延長，經過原平臺象限次數顯著減少（P ＜ 0.05），miR-711 antagomir組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短，經過原平臺象限次數顯著增加（P ＜ 0.05）。結果見表2。

3.2 ? Dex對TBI大鼠神經功能的影響

與Sham組比較，TBI組大鼠神經行為學評分與運動功能評分均顯著降低（P ＜ 0.05）；與TBI組比較，Dex組大鼠神經行為學評分與運動功能評分均顯著提高（P ＜ 0.05）；與Dex組比較，miR-NC組大鼠神經行為學評分與運動功能評分無顯著差異（P ＞ 0.05）；與miR-NC組比較，miR-711 agomir組大鼠神經行為學評分與運動功能評分顯著降低（P ＜ 0.05），miR-711 antagomir組大鼠神經行為學評分與運動功能評分顯著提高（P ＜ 0.05）。結果見表3。

3.3 ? Dex對TBI大鼠海馬組織病理損傷的影響

與Sham組比較，TBI后海馬組織出現明顯出血水腫，組織中神經元排列紊亂，細胞核固縮，可見細胞變性；與TBI組比較，Dex組大鼠海馬組織病理損傷明顯減輕；與Dex組比較，miR-NC組病理結構的改變類似；與miR-NC比較，miR-711 agomir組海馬組織病理損傷加重，神經元排列松散，可見水腫變性，miR-711 antagomir組海馬組織病理損傷顯著改善。見圖1。

3.4 ? Dex對TBI大鼠海馬組織中miR-711、GDNF mRNA表達的影響

與Sham組比較，TBI組大鼠海馬組織中miR-711表達顯著升高，GDNF mRNA表達顯著降低（P ＜ 0.05）；與TBI組比較，Dex組大鼠海馬組織中miR-711表達顯著降低，GDNF mRNA表達顯著升高（P ＜ 0.05）；與Dex組比較，miR-NC組上述指標的變化無顯著差異（P ＞ 0.05）；與miR-NC組比較，miR-711 agomir組大鼠海馬組織中miR-711表達顯著升高，GDNF mRNA表達顯著降低（P ＜ 0.05），miR-711 antagomir組大鼠海馬組織中miR-711表達顯著降低，GDNF mRNA表達顯著升高（P ＜ 0.05）。結果見表4。

表5顯示，與miR-NC組比較，miR-711組轉染GDNF-WT的細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P ＜ 0.05），轉染GDNF-MUT的細胞相對熒光素酶活性無顯著差異（P ＞ 0.05）。

3.6 ? Dex對TBI大鼠海馬組織中GDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與Sham組比較，TBI組大鼠海馬組織中GDNF、Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高（P ＜ 0.05）；與TBI組比較，Dex組大鼠海馬組織中GDNF、Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低（P ＜ 0.05）；與Dex組比較，miR-NC組上述蛋白的表達差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；與miR-NC組比較，miR-711 agomir組大鼠海馬組織中GDNF、Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高（P ＜ 0.05），miR-711 antagomir組大鼠海馬組織中GDNF、Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低（P ＜ 0.05）。結果見圖3、表6。

4 ? ?討論

由于顱腦結構的特殊性與功能重要性，大部分TBI患者都會遺留長期神經功能障礙狀態［ 17 ］。TBI損傷主要是最初外力擊打造成的原發性神經元和組織受損，經過一系列繼發性病理變化，如炎性反應、氧化應激、細胞凋亡等導致大量神經元死亡，最終導致神經元丟失，造成不可逆的神經功能障礙［ 18-19 ］。因此，TBI發生后，進行及時有效的治療，對TBI患者神經功能的修復具有關鍵意義。本研究通過采用改良自由落體法建立TBI模型，Morris水迷宮實驗結果可知，TBI后大鼠認知功能出現明顯障礙，行為學與運動能力也明顯降低，海馬組織中可見明顯病變，神經元水腫變性，出現核固縮現象，提示TBI模型建立成功，大鼠認知功能出現障礙，神經損傷現象發生。Dex已被證實在缺血性腦損傷、TBI等疾病中能夠抑制神經元凋亡，發揮腦保護作用［ 20-21 ］。本研究結果顯示，Dex干預后的TBI大鼠認知功能得到一定程度的改善，海馬組織病變減輕，海馬組織中Bcl-2蛋白表達明顯上調，Bax蛋白表達下調，提示Dex在TBI后神經損傷中發揮神經保護作用，并可能與抑制神經元凋亡有關，與李坪等［ 15 ］研究結果一致。

miRNA是一類高保守的非編碼單鏈RNA，具有調控生命活動的作用，在中樞神經系統中參與神經細胞的生長與分化［ 22 ］。已有研究表明，上調miR-711的表達，引起DNA修復機制受阻，誘導神經元凋亡，引起神經退行性病變［ 23 ］。GDNF是一種生物活性極強的神經營養因子，研究發現，其能夠通過抑制小膠質細胞活化和炎癥反應，減少神經元凋亡，參與中樞神經系統神經元的存活與修復［ 24 ］。本研究結果顯示，TBI大鼠海馬組織中miR-711的表達明顯增加，GDNF mRNA與蛋白表達均顯著降低；另外，生物信息學網站預測與雙熒光素酶報告基因實驗證實GDNF是miR-711的靶基因，提示TBI后miR-711表達上調，抑制GDNF的表達，引起神經損傷。Dex干預后TBI大鼠海馬組織中miR-711表達下調，GDNF表達上調，提示Dex可能通過調控miR-711/GDNF信號軸發揮神經保護作用。另外，本研究結果顯示，過表達miR-711可以顯著逆轉Dex對TBI大鼠的神經保護作用，抑制miR-711表達又可以進一步促進Dex的神經保護作用，證實Dex改善認知功能障礙，減輕神經損傷，可能與miR-711/GDNF信號軸有關。

綜上所述，Dex能夠有效改善TBI大鼠認知障礙，減少神經元凋亡，減輕神經損傷，發揮腦保護作用，可能通過調控TBI后大鼠海馬組織miR-711/GDNF信號軸的表達實現。這為臨床上使用Dex作為TBI的新治療手段提供了新的實驗基礎。但TBI病理機制復雜，本實驗僅對認知障礙、組織損傷以及神經元凋亡相關蛋白表達進行了初步檢測，其他機制還需進一步進行探索。

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Impacts of Dexmedetomidine on Cognitive Impairment

and Neurological Damage in Rats with Traumatic Brain

Injury by Regulating miR-711/GDNF Signaling Axis

WANG ?Hui

（Laboratory Animal Center， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China）

Abstract：Objective： To investigate whether dexmedetomidine （Dex） can improve cognitive impairment and neurological damage in rats with traumatic brain injury （TBI） by regulating the miR-711/glial cell-derived neurotrophic factor （GDNF） signaling axis. Methods： Rats were randomly divided into sham operation group （Sham group）， TBI group， Dex group， miR-NC group， miR-711 agomir group， and miR-711 antagomir group， with 10 rats in each group. A TBI rat model was established by using a brain injury hammer to hit with a free fall. Conclusion： Dex may alleviate pathological damage in the hippocampus by regulating the miR-711/GDNF signaling axis， inhibit the expression of pro-apoptotic proteins， improve cognitive impairment and neural damage after TBI， and exert a protective effect on the brain.

Key words：dexmedetomidine; miR-711; glial cell-derived neurotrophic factor; traumatic brain injury; cognitive impairment; nerve injury

［責任編輯：許立群］