玉米開花期相關性狀的QTL定位與候選基因分析

郭 爽, 王 棟, 聶 蕾, 何 玥, 涂 亮, 劉鵬飛,郭向陽, 王安貴, 祝云芳, 吳 迅,3, 陳澤輝

(1.貴州大學農學院, 貴陽 550025; 2.貴州省農業科學院旱糧研究所, 貴陽 550006;3.農業農村部喀斯特山區作物基因資源與種質創新重點實驗室, 貴陽 550006)

玉米作為重要的糧食、飼料和工業原料作物,在社會經濟發展中發揮著重要作用。開花期相關性狀是植物響應環境變化的關鍵性狀,在植物繁衍和適應生態環境等方面都具有非常重要的作用[1],不同玉米品種對光照長度的響應存在差異,表現出在長短日照條件下的開花期差異,如大部分熱帶玉米種質在熱帶地區能正常開花,而到了溫帶地區則出現徒長不能正常開花結實的現象,也是熱帶玉米引種溫帶種植迫切需要解決的關鍵問題。植物花發育的過程一般要歷經開花誘導、花原基形成、花器官發育這3個階段[2]。玉米開花誘導調控網絡主要分(光周期途徑、自主途徑、赤霉素途徑和年齡途徑)4個途徑[1],其作為典型的數量性狀,遺傳方式復雜且受環境影響嚴重。為了探究玉米開花期性狀的遺傳規律,多數研究者圍繞開花期相關性狀進行QTL定位和基因挖掘,以提高育種選擇效率。侯清桂等[3]以豫86×豫M1-7構建的RIL群體為材料,對玉米開花期相關性狀進行QTL分析,共鑒定到48個開花期性狀相關的QTLs,包括18個抽雄期QTLs、16個吐絲期QTLs和14個散粉期QTLs。這些QTLs在除第4號和第8號染色體外的其他染色體上都有分布,其中單個QTL表型貢獻率在1.67%～20.33%之間。王迪等[4]以自交系齊319和掖478分別與黃早四雜交構建的230個和235個F2∶3家系為材料,利用完備區間作圖方法,對不同生態環境玉米花期相關性狀進行QTL定位,其中在玉米Q/H群體的10個連鎖群上共定位到了85個QTLs,有30個QTLs在Y/H群體被檢測到,并呈現成簇分布。因此,較多研究者利用經典遺傳學方法,通過數量性狀基因組(QTL)初步定位、精細定位,最終實現目標基因的圖位克隆。眾多學者也鑒定出一批與玉米開花相關的重要基因,如ZmCCT[5],Vgt1[6]、ZCN8[7]、Dwarf[8]和ZmCCT9[9]等。高媛等[10]在對Suwan種質代表性自交系T32和QR273的開花相關基因差異表達模式的研究中發現,長日照條件開花促進基因ZmCOL、ZmELF4、ZmGI、ZmHd1、ZmHd6、ZCN8在光鈍感系QR273中的相對表達量顯著高于光敏感系T32;開花抑制基因ZmCCT9、ZmCCT10的相對表達量則顯著低于T32。這些研究為深度解析玉米開花相關性狀變異的遺傳機制以及育種改良利用提供了依據。綜上所述,針對開花期相關性狀定位到的QTL在數量、位置、基因效應上因所用材料、標記等不同而存在差異,玉米開花期性狀遺傳基礎和基因調控網絡較為復雜。因此,本研究通過選用熱帶種質選育骨干親本QR273和T32為親本構建的150份F2和F2∶3分離家系為材料,基于簡化基因組測序(GBS)技術對F2單株進行基因型鑒定,同時對該群體的F2∶3家系進行多個環境開花期相關性狀評價,利用完備區間作圖法對開花期相關性狀進行QTL定位。在此基礎上,利用生物信息分析方法篩選玉米開花期相關的候選基因,為基于分子輔助的玉米開花期性狀改良提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以熱帶種質選育玉米骨干親本QR273和T32為親本,構建包含150個家系的F2、F2∶3家系為材料。T32是貴州省農業科學院旱糧研究所從Suwan種質中選育而成的骨干自交系,表現為光周期敏感特點,即在長日照地區會出現開花期延遲甚至不能正常開花結實等現象;QR273是以Suwan群體作基礎材料,經過5年8代自交選育而成的優良玉米骨干自交系,表現為光周期鈍感的特點,即在長、短日照條件下均表現為正常開花結實的特征。

1.2 田間試驗及測定方法

2021年10月,將構建的F2分離群體與親本種植于海南省三亞市,對幼苗5葉期的單株進行取樣,并采用改良CTAB法對DNA進行提取,隨后DNA質量檢測和GBS測序委托北京康普生生物有限公司完成,具體過程參照吳迅等[7]的方法。同時對F2植株進行單株自交后可獲得F2∶3家系種子。

2022年4月以及2022年10月,將F2∶3群體以及親本材料分別種植于貴州省貴陽市、甘肅省張掖市和海南省三亞市,材料的種植采用隨機區組設計,2次重復,行長3 m,行距0.65 m。田間管理的方式與當地一致。田間調查玉米抽雄期、散粉期、吐絲期,性狀評價參考石云素等[11]的方法。

1.3 數據分析

通過Excel軟件對表型數據進行整理,SPSS26.0軟件進行統計分析。分別計算3個環境下親本與不同家系的抽雄期、散粉期、吐絲期的平均值、變異系數、偏度、峰度、方差等,并進行相關性分析。

1.4 QTL定位與候選基因預測

對獲得的SNP標記進行篩選,刪除等位基因頻率MAF<0.05的SNP位點后,共獲得68 994個高質量SNP標記可用于后續分析。利用IciMapping4.1軟件中的完備區間作圖法(ICIM)對3個開花期相關性狀進行QTL檢測。其中,作圖步長為1.00 cM,PIN為0.001,LOD閾值為2.50。根據3種環境中的定位結果和已報道的QTL相關信息,以是否存在重疊區域為標準對“一致性”QTL進行判斷,若存在重疊區域,則認為是“一致性”QTL[12]。在此基礎上,結合B73參考基因組序列(RefGen_v4),查找在“一致性”QTL區間內控制目標性狀的候選基因,并結合基因功能注釋和已有研究報道,對關鍵候選基因進行篩選。

2 結果與分析

2.1 開花期相關性狀數據分析

對開花期相關性狀的統計分析結果顯示,在張掖市和貴陽市,開花期相關性狀在基因型間表現出顯著差異。親本T32的抽雄期、散粉期、吐絲期的平均值均高于親本QR273。且這3個開花期相關性狀在不同家系間差異顯著。其開花期相關性狀的偏度和峰值的絕對值均小于1,符合正態分布,可作QTL定位分析(表1)。

表1 開花期相關性狀的描述性統計Table 1 The descriptive statistical of related traits at flowering stage

2.2 開花期性狀相關性分析

開花期相關性狀間的相關性分析結果列于表2。結果顯示,抽雄期與散粉期、吐絲期,散粉期與吐絲期在張掖市、貴陽市、三亞市三地均呈極顯著正相關,說明3個開花期性狀通過相互協同作用促進玉米生長發育的調控,這與劉穎等[13]研究結果一致。

表2 開花期性狀的相關性分析Table 2 Correlation analysis between related traits at flowering stage under three environments

2.3 SNP圖譜構建

依據獲得的高質量SNP標記的物理圖譜,68 994個SNPs均勻地分布在染色體上(圖1)。各染色體上的標記數量大小依次表現為Ch4、Ch2、Ch1、Ch3、Ch5、Ch8、Ch9、Ch7、Ch6、Ch10,其數量分別為8 901個、8 824個、8 725個、7 623個、7 174個、6 407個、5 782個、5 592個、5 432個、4 534個。

注:每一行代表一個SNP標記,淺色表示標記的密度較低,深色表示標記的密度較高。圖1 遺傳圖譜Fig.1 Genetic map

2.4 控制開花期相關性狀的QTL

3個開花期相關性狀的QTL定位結果列于表3。結果顯示,3個環境下共檢測到98個開花期相關QTL,其中37個QTL與抽雄期相關,分別位于1號、2號、5號、6號、7號、9號、10號染色體上,單個QTL的貢獻率在0.85%～12.43%之間,且12個QTL的增效基因來源于親本T32,23個QTL的增效等位基因來源于親本QR273;與散粉期有關的QTL27個,各個染色體上均有分布。單個QTL的貢獻率在3.29%～8.64%之間,且10個QTL的增效基因來源于親本T32,17個QTL的增效等位基因來源于親本QR273。

表3 玉米開花期相關性狀QTL定位結果Table 3 QTL mapping results of maize related traits at flowering stage

與吐絲期有關的QTL 30個,各個染色體上均有分布。單個QTL的貢獻率在1.78%～10.24%之間,其中有6個QTL的增效基因來源于親本T32,24個QTL的增效等位基因來源于親本QR273。共檢測到8個貢獻率大于8%的QTL,其中3個與抽雄期相關,2個與散粉期相關,3個與吐絲期相關,分別位于第4號染色體上的142.2～142.4 Mb之間,第2號染色體上的5.3～5.8 Mb之間、第5號染色體上的115.2～115.4 Mb之間、第9號染色體上的76.4～76.6 Mb之間、第7號染色體上的55.0～55.1 Mb、第9號染色體上的76.4～76.6 Mb之間、第4號染色體上的133.1～133.2 Mb之間、第9號染色體上的88.0～89.1 Mb之間。

2.5 一致性QTL

通過比較不同環境下的QTL定位結果發現,在第1,4,6,9號染色體上分別存在QTL富集區域即同一標記區間影響多個目標性狀。如在第1號染色體的68.0～68.3 Mb區間檢測到一個控制抽雄期和散粉期的QTL,在第4號染色體的63.2～63.4 Mb區間內檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL,在第4號染色體的133.1～134.1 Mb區間檢測到一個同時控制散粉期和吐絲期的QTL,在第6號染色體的129.3～129.5 Mb區間內檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL。在第9號染色體的76.5～76.6 Mb區間內檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL。與已公開QTL數據庫的比對發現,本研究有8個檢測到的QTL與前人定位結果一致,分別控制抽雄期、散粉期和吐絲期的變異,可作為下一步精細定位的候選靶標。

2.6 候選基因分析

結合Maize GDB數據庫的基因功能注釋信息以及前人的研究結果,對篩選出的8個一致性QTL進行目標候選基因分析,初步預測出12個候選基因與開花期相關(表4)。侯選基因中,Zm00001d052638、Zm00001d025735、Zm00001d025739、Zm00001d022350、Zm00001d005135參與編碼蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。沈辰[14]通過實時定量PCR分析發現,絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因在山核桃的多個器官中均有表達,其中在花芽中表達量最高,且這些表達存在于山核桃雌花和雄花的整個發育過程。Zm00001d052585編碼苯丙素生物合成過程。武紹龍等[15]研究發現,馬纓杜鵑花開花至代謝進程中,苯丙素類代謝物表達量逐漸升高,表明苯丙素類代謝物表達可能與馬纓杜鵑花發育有關,Zm00001d052637參與對激素的反應。激素是調控植物生長發育重要的物質之一,在植物的開花方面發揮著重要的調控作用。Zm00001d047632參與紅光、遠紅光光傳導,曹凱等[16]研究發現,紅光與遠紅光比值低的環境會抑制野生型番茄和phyB1突變體番茄開花。Zm00001d042717與乙烯激活的信號通路相關,張華等[17]研究表明,75 mg/L乙烯利處理對植株花枝數、花朵數、始花期及開花總時長均有明顯的促進作用。任小林等[18]研究發現,秋施乙烯利可使牡丹的落葉期提前,萌芽期和開花期延遲,且顯著降低了開花率,減小了花徑,并且增加了畸形花的百分率。Zm00001d044325、Zm00001d003383均參與生長素激活的信號通路。也有研究表明,生長素對植物的開花具有影響。楊洪全等[19]研究發現,光激活的CRY1和phyB能夠通過直接結合和穩定AUX/IAA來抑制生長素信號通路,說明光和生長素可以拮抗調節AUX/IAA的穩定性,從而平衡生長素和光對植物生長發育的影響。生長素能夠通過與細胞分裂素、茉莉素以及脫落酸之間的相互作用來共同影響植物的生長發育[20]。Zm00001d003379、Zm00001d042721參與脫落酸激活的信號通路,鄧全恩[21]用赤霉素對油茶花進行處理時發現,當赤霉素濃度為400 mg/L時,油茶花始花期最早且盛花期集中,150 mg/L脫落酸處理時,始花期最晚;高英[22]對核桃花芽分化過程中脫落酸進行原位分析發現,由葉芽狀態向雌花芽轉化時,頂端分生組織中脫落酸的水平明顯降低,對生長素和脫落酸的進行平衡分析后發現雌花芽的誘導需要較高水平的脫落酸/生長素。

表4 基因位置及功能注釋Table 4 The gene location and function annotation

3 結果與討論

本研究共定位到8個控制開花期相關性狀的一致性QTL,包括郭瑞[23]利用光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早四為材料構建F2∶3作圖群體,在第2號染色體和第9號染色體上分別檢測到1個與吐絲期相關的QTL和1個與抽雄期相關的QTL,對應區間為26.1～120.3 Mb和127.0～139.5 Mb(B73RefGen_v4),本研究也在第2號染色體42.0～42.6 Mb和第9號染色體137.4～137.7 Mb分別定位到1個吐絲期QTL和1個散粉期QTL;郭瑞還利用光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早四為材料構建F2∶3作圖群體,在第2號染色體和10號染色體上分別檢測到2個與抽雄期相關的QTL,對應區間為26.1～208.9 Mb和115.7～140.3 Mb(B73RefGen_v4);本研究也在第2號染色體160.4～160.5 Mb和第10號染色體127.7～128.2 Mb內分別定位到1個散粉期QTL;魏海忠[24]以玉米自交系80007和80044衍生的包含355個家系的F9重組自交系(RIL)群為材料,采用SSR標記在第3號染色體檢測到1個與散粉期相關QTL,對應區間為224.5～225.3 Mb(B73 RefGen_v4);本研究在3號染色體225.2～225.3 Mb定位到1個散粉期QTL;李永明等[25]利用4個玉米自交系組配276/72//A188/交51四交群體,構建了包含213個SSR分子標記的遺傳連鎖圖譜在第3號染色體上和第7號染色體上分別檢測到1個與散粉期相關的QTL和1個與吐絲期有關的QTL,對應區間為171.0～194.8 Mb和170.3～177.3 Mb(B73RefGen_v4);本研究在3號染色體178.1～178.4 Mb和第7號染色體175.8～176.1 Mb上也分別定位到1個散粉期QTL和1個吐絲期QTL。李志敏[26]在第4號染色體上檢測到1個與抽雄期相關的QTL,對應區間為189.1～216.4 Mb(B73 RefGen_v4);本研究在第4號染色體195.2～195.5 Mb內定位到了1個抽雄期QTL。由此推測這些一致性位點在玉米馴化過程中表達較穩定,可作為進一步精細定位并挖掘關鍵候選基因的候選靶標。

除此之外,本研究還檢測出12個開花期相關的候選基因,主要參與激素合成、運輸及信號轉導等,所編碼蛋白在作物生長發育過程中參與酶類調控和激素調節。與在山核桃、番茄等植物中的研究基本一致。研究結果能夠為后續的精細定位與候選基因的圖位克隆提供新的靶標。