CEACAM1在肺腺癌中表達及免疫浸潤分析

陳海欣 陳平 陳婷婷

肺癌是發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其主要病理類型包括非小細胞肺癌（NSCLC）及小細胞肺癌（SCLC），其中NSCLC 約占85%［1］。肺腺癌（LUAD）是原發性肺癌中最常見的組織學亞型，50%的LUAD患者被發現時已經處于晚期并存在遠處轉移，轉移性肺癌5 年生存率為4%~18%［2-3］。癌胚抗原（CEA）作為惡性腫瘤診斷的重要指標，在結腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤中表達均存在增高［4］。CEA 作為一種細胞膜結構蛋白，參與細胞黏附，異常升高可以促進腫瘤細胞轉移［5］。癌胚抗原相關細胞黏附分子1（CEACAM1）是CEA 家族中唯一在T 細胞和NK 細胞等免疫細胞上表達的成員，抑制免疫細胞抗腫瘤功能［6］。本研究擬通過TCGA-LUAD 和HPA 數據庫，分析CEACAM1 在LUAD 腫瘤組織中表達情況，CEACAM1 與腫瘤浸潤免疫細胞的相關性，探索CEACAM1 與多種免疫檢查點共表達關系，分析CEACAM1 在LUAD 免疫細胞中調節作用以及CEACAM1 在LUAD 參與的信號通路，為CEACAM1 是否可以作為治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料收集 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載LUAD 項目中HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 數據和患者臨床資料用于CEACAM1 差異表達、免疫浸潤、免疫檢查點共表達及通路富集分析。

1.2 方法 （1）差異表達分析：對TCGA-LUAD 數據庫中腫瘤組織和癌旁組織CEACAM1 表達進行差異分析，R 軟件包“ggplot2”用于可視化分析。通過HPA 數據庫（https：//www.proteinatlas.org）分析LUAD 腫瘤組織中免疫組化結果，分析腫瘤組織和癌旁組織中CEACAM1 表達差異。（2）KM 生存曲線分析：應用KM 數據庫（http：//kmplot.com/analysis/）分析不同病理分期CEACAM1 高低表達組總生存率（overall survival rate，OS）差異。（3）免疫浸潤分析：應用R 軟件包“GSVA”進行免疫浸潤分析，免疫浸潤算法為ssGSEA。分析CEACAM1 與腫瘤浸潤的免疫細胞的相關性，免疫細胞選擇活化的樹突狀細胞（aDC）、B 細胞、CD8T 細胞、細胞毒性細胞、DC細胞、嗜酸性粒細胞、幼稚的樹突狀細胞（iDC）、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞，CD56+NK 細胞，CD56-NK 細胞、NK 細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）、T細胞、T 輔助細胞、中央記憶型T 細胞（Tcm）、效應記憶T 細胞（Tem）、濾泡輔助性T 細胞（TFH）、γδ T細胞、Th1 細胞、Th17 細胞、Th2 細胞和調節性T 細胞（Treg）。（4）CEACAM1 與其他免疫檢查點共表達情況分析：應用R 軟件包“ggplot2”用于可視化分析，分析CEACAM1 與其余8 個免疫檢查點（SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3 和PDCD1LG2）共表達情況。（5）通路富集分析：根據CEACAM1 表達情況分為低表達組和高表達組，分析兩組中存在表達差異顯著的基因，并通過GSEA 基因富集分析。使用P值和歸一化富集分數（normalized enrichment fraction，NES）對每個表型中富集的途徑進行分類。若錯誤發現率（false discovery rate，FDR）<0.25 且校準P<0.05 表明在高表達表型中顯著富集。

1.3 統計學分析 采用SPSS 18.0 統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，兩組比較用t檢驗；偏態分布計量資料以M（Q1，Q3）表示，兩組比較用秩和檢驗；計數資料以n（%）表示，用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料比較 TCGA-LUAD 數據庫中，排除缺少RNAseq 數據或臨床信息的患者，相同患者保留原位癌數據，最后共篩選出535 例LUAD 患者納入本次分析，以肺腫瘤組織中CEACAM1 表達量的中位值作為界限，將患者分成高表達組（268 例）和低表達組（267例）。見表1。

表1 LUAD患者臨床資料

2.2 CEACAM1 在腫瘤組織和癌旁組織表達差異 通過非配對樣本檢驗，LUAD 患者腫瘤組織中CEACAM1的含量高于癌旁組織的平均水平，兩組差值為1.502（1.38~1.625），差異有統計學意義（t=24.151，P<0.001）；通過配對樣本檢驗，腫瘤組織中CEACAM1 的含量也高于癌旁組織的平均水平，兩組差值為1.423（1.134~1.712），差異有統計學意義（t=9.857，P<0.001）。見圖1。

圖1 CEACAM1在腫瘤組織和癌旁組織表達

2.3 CEACAM1 免疫組化結果分析 CEACAM1 在腫瘤組織中高表達，在正常肺組織中幾乎不表達，見圖2。

圖2 CEACAM1在腫瘤組織和癌旁組織免疫組化結果（HPA數據庫）

2.4 KM 生存曲線分析 在LUAD 中，CEACAM1 高表達患者OS 偏低（P<0.05）。由于IV 期患者數不足，因此只單獨列出I、II、III 期和總LUAD 患者KM 生存曲線，結果顯示I 和II 期高表達CEACAM1 的LUAD 患者OS 偏低（P<0.05）。而在III 期LUAD 患者中OS 差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 LUAD中CEACAM1高低表達組KM生存曲線分析

2.5 免疫浸潤相關性分析 CEACAM1 與aDC、B 細胞、嗜酸性粒細胞、iDC、T 細胞、TFH、Th1 細胞和Treg 細胞存在正相關（P<0.05），相關系數分別為0.192、0.109、0.124、0.087、0.146、0.288、0.089 和0.156，見圖4。

圖4 CEACAM1與腫瘤浸潤免疫細胞相關性分析

2.6 CEACAM1 與免疫檢查點共表達分析 CEACAM1與SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4和LAG3 共表達情況存在正相關（P<0.05），Spearman相關系數分別為0.141、0.166、0.092、0.108、0.149、0.163 和0.147，見圖5。

圖5 CEACAM1與免疫檢查點分子共表達情況

2.7 通路富集分析 通過GSEA 通路富集分析，發現CEACAM1 與Rho GTP 酶信號傳導、M 期有絲分裂、NABA 分泌因子、DNA 修復以及氨基酸及其衍生物的代謝通路相關。見圖6。

圖6 GSEA通路富集分析

3 討論

LUAD 作為肺癌的主要病理類型，雖然惡性程度不高，發展進程比較緩慢，但存在微轉移灶，即使肺部病灶較小時也會發生血道轉移以及淋巴轉移，大多數患者被診斷時，病情已經發展至中晚期，并且可能已經擴散到全身各處［7］。隨著CEACAM 家族研究的深入，CEACAM1 在各種癌癥中的研究也日益增多，比如結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、甲狀腺癌以及黑色素瘤等［8-9］。在NSCLC 中，與健康者比較，CEACAM1 基因表達上調［10］。CEACAM1 可以通過改變細胞間的黏附能力，細胞間空隙增大使得腫瘤細胞侵襲進入組織器官，導致腫瘤侵襲和轉移；通過促進VEGF的表達，使機體生成新生血管及淋巴管從而促進腫瘤轉移［11］。有研究表明，在NSCLC 患者血清中，存在CEACAM1 水平升高，且表達水平和TGF-β、VEGF-A、IL-8 密切相關，提示CEACAM1 可以預測肺癌發生、進展以及預后，并有可能為肺癌治療提供靶點［12］。另外，CEACAM1 免疫抑制劑（MG1124）在NSCLC PDX人源化小鼠模型中，MG1124 作為單一療法可以抑制肺癌的生長，在NSCLC huPDX 模型中顯示出與派姆單抗的協同抗癌活性。CEACAM1 作為近年新發現的免疫檢查點，可以與TIM-3 相互作用抑制T 細胞抗腫瘤作用，使腫瘤細胞逃避免疫監視［13］。

本研究結果顯示，與癌旁組織比較，LUAD 患者腫瘤組織中CEACAM1 mRNA 高表達。在一項CEACAM1和NSCLC 研究中，腫瘤組織中CEACAM1 高表達，表明CEACAM1 與NSCLC 存在關聯［14］。通過KM 生存曲線分析，發現CEACAM1 高表達的早期LUAD 患者中OS偏低，推測CEACAM1 有可能是早期LUAD 不良預后指標。CEACAM1 作為免疫檢查點，能夠在免疫細胞上表達，從而調節免疫細胞激活程度，而免疫細胞的狀態和患者的預后也密切相關，分析LUAD 患者CEACAM1與腫瘤浸潤的免疫細胞相關性，結果顯示CEACAM1 與多種免疫細胞呈正相關（P<0.05），其中與TFH 細胞相關性最顯著。有研究表明，NSCLC 患者TFH 細胞上不僅存在PD1 高表達，也存在TFH 功能異常，功能異常可以進一步抑制免疫功能，搶救TFH 的功能可以作為NSCLC 患者潛在的治療策略［15］。研究證實LUAD 中CEACAM1 與TFH 浸潤呈正相關，高表達的CEACAM1也同樣會抑制TFH 細胞功能，通過靶向抑制CEACAM1也有可能幫助恢復TFH 功能，從而也能對LUAD 患者起到治療作用。CEACAM1 作為免疫檢查點，可以與其他免疫檢查點互相作用，如與TIM-3 結合對免疫細胞進行調控［15］。分析CEACAM1 與其他八種免疫檢查點分子共表達情況，結果顯示CEACAM1 與SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4 和LAG3 共表達情況存在正相關（P<0.05），提示可以聯合多個免疫檢查點抑制劑作為LUAD 治療的新策略。根據腫瘤組織中CEACAM1 表達水平分為高低表達組，兩組中存在顯著差異的基因，通過GSEA 通路富集分析，發現CEACAM1 與Rho GTP 酶信號傳導、M 期有絲分裂、NABA 分泌因子、DNA 修復以及氨基酸及其衍生物的代謝通路相關。Rho GTP 酶屬于Ras 超家族，參與細胞遷移、吞噬、收縮和黏附，Rho/ROCK 信號通路可以誘導細胞骨架重建、導致內皮細胞通透性改變，與腫瘤的發生密切相關［16］。細胞分裂周期M 期通路，也有研究表明CDC 25C 可以預測LUAD 的不良預后，并可能在細胞周期調節和FAS 介導的細胞凋亡中發揮作用，其中CDC25C 參與G2/M 期轉變的調節［17］。DNA 修復也與腫瘤密切相關，當修復系統存在延長，可能導致腫瘤發生。尚斌通過實驗發現過表達Ku80 基因可以增加LUAD 細胞增殖、運動、遷移以及侵襲能力，其中Ku80基因是DNA 修復基因［18］。在多種腫瘤，如乳腺癌患者血清中存在氨基酸代謝圖譜的改變［19］。根據基因富集分析，發現CEACAM1 參與的信號通路與腫瘤的發生密切相關，因此靶向CEACAM1 有可能阻止腫瘤的發生。綜上所述，LUAD 的腫瘤組織中CEACAM1 高表達，且與腫瘤組織浸潤的多種免疫細胞呈正相關。CEACAM1作為免疫檢查點，在免疫細胞上高表達，可以抑制免疫細胞抗腫瘤功能，導致腫瘤細胞逃避免疫監視。另外，在LUAD 中，CEACAM1 可以和多種免疫檢查點共表達，可能對免疫抑制起到協同作用。