河套地區中溫大曲真菌類群與理化指標關聯性分析

王玉榮,雷炎,劉忠軍,張敏,李擎,郭壯*

1(湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創新中心,湖北 襄陽,441053) 3(清香型白酒生物技術襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽,441053) 4(內蒙古河套酒業集團股份有限公司,內蒙古 巴彥淖爾,015400)

作為白酒釀造過程中重要的發酵劑、糖化劑和生香劑,大曲的質量及其微生物群落結構在白酒釀造中至關重要[1]。根據制曲溫度的不同可將釀酒大曲分為低溫大曲(40～50 ℃)、中溫大曲(50～60 ℃)和高溫大曲(60～70 ℃),不同類大曲的微生物群落豐度和多樣性存在差異,適用于不同香型的白酒,其中中溫大曲適用于生產濃香型白酒[2]。HOU等[3]對中溫大曲進行分析,表明大曲從發酵到貯存過程中其內部和外部的微生物群落和理化特性發生明顯變化。YANG等[4]基于宏基因組學對中溫大曲中參與風味代謝的微生物進行分析,表明大曲的品質可以顯著影響白酒的感官特性,且不同微生物的代謝作用各有不同。肖辰[5]通過分析瀘型酒中溫大曲對酒醅發酵的作用發現曲中酯類、醇類以及酸類等揮發性物質多出現在酒醅和基酒中,且酒醅和基酒中風味物質含量明顯提高。

高通量測序技術(high-throughput sequencing technology,HTS)為現代生命科學研究提供了前所未有的機遇[6]。基于該技術研究人員實現了對大曲中微生物群落結構的解析、微生物來源的探究以及不同階段大曲微生物群落結構演替的分析等。周森等[7]利用HTS對清香型白酒大曲微生物多樣性結構進行解析,結果顯示樣品中真菌豐度遠大于細菌豐度,且不同大曲樣品真菌群落主體均為扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),細菌群落結構則較為多樣化。周天慈等[8]對中高溫大曲微生物群落結構及其來源進行解析發現發酵初期大曲中細菌和真菌的主要來源分別為制曲原料和制曲環境,其中大曲中真菌53.7%來自于室外地面,23%來自于室內屋頂。HE等[9]通過MiSeq高通量技術對濃香型白酒大曲發酵和貯存階段微生物群落結構進行分析可知,大曲發酵和貯存階段微生物群落組成基本不變,相對豐度含量有所變化,嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、根霉屬(Rhizopus)、畢赤酵母屬(Pichia)和根毛霉屬(Rhizomucor)為大曲中的優勢真菌屬。由此可知,釀酒大曲中含有豐富的真菌群落結構,且大曲中微生物受到制曲原料和制曲環境的影響可能組成不同,因而對不同來源大曲中真菌類群進行解析是很有必要的。

河套地區屬于溫帶大陸性氣候,位于黃河中上游地區,擁有良好的自然環境和土壤條件,是中國西北最主要的農業區之一。本研究使用HTS技術對采集自河套地區某酒廠制曲車間的5份中溫大曲樣品進行真菌群落結構的解析,通過對大曲理化特性指標的測定分析大曲品質,從而進一步探究大曲中真菌群落結構對理化特性的影響,并通過傳統微生物技術對大曲樣品中的酵母菌進行解析。本研究側重于對中溫大曲真菌微生物群落結構的解析,有助于篩選大曲中優良發酵菌株,從而提升白酒品質,同時為釀酒大曲的規范化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中溫大曲,河套地區某酒廠制曲車間;QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒,德國QIAGEN公司;Axygen清潔試劑盒,康寧生命科學(吳江)有限公司;引物ITS3F/ITS4R、ITS1/ITS4和M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠生物科技有限公司;5×TransStartTMFastPfu Buffer、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、2×PCR Buffer、rTaq酶、PMD 18-T載體,北京全式金生物技術有限公司;Escherichiacolitop10,湖北省食品配料工程技術研究中心制備;氫氧化鈉、鹽酸、次甲基藍、可溶性淀粉、硫酸、甲醛、己酸,國藥集團化學試劑有限公司;無水乙酸鈉、氯化鈉、冰乙酸、氯化鈷、無水乙醇,西隴化工股份有限公司;葡萄糖和重鉻酸鉀,天津市福晨化學試劑廠;PDA培養基,上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BF-10小型高速粉碎機,河北本辰科技有限公司;5810R型臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;DYY-12型電泳儀,北京六一儀器廠;vetiri梯度基因擴增儀,美國AB公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統,美國ProteinSimple公司;ND-2000C微量紫外分光光度計,美國Nano Drop公司;Miseq PE300型高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機架式服務器,美國DELL公司;GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱:上海博迅實業有限公司;DHS-16水分測定儀,寧波市鄞州華豐電子儀器廠;K1100全自動凱氏定氮儀,山東海能科學儀器有限公司;KSL-1200X-M馬弗爐,合肥科晶材料技術有限公司;HR40-IIB2生物安全柜,海爾集團電子商務有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 中溫大曲樣品的制備和采集

制曲的工藝流程如下[10]:

制曲原料(優質冬小麥)→潤料→粉碎→拌料壓曲→入房臥曲→噴酒強化→培曲翻曲→出房入庫→大曲貯存

樣品的采集和預處理:從制曲車間選擇顏色均勻、厚度適中、有特殊香氣[11]的中溫大曲共5份,編號為HT1～HT5。在實驗室條件下,將整塊大曲進行切割粉碎,置于無菌自封袋中低溫貯存。

1.3.2 樣品宏基因組DNA提取、真菌ITS區PCR擴增和MiSeq測序

本研究參考QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒中的方法,提取中溫大曲樣品中宏基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)對樣品總DNA進行檢測,將檢測合格的DNA作為模板進行PCR擴增[12]。經過檢測將擴增出目的片段的PCR產物使用清潔試劑盒進行清潔,并通過微量紫外分光光度計檢測PCR清潔產物的濃度[13],用無菌ddH2O將濃度稀釋至100 nmol/L后寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列下機處理和生物信息學分析

MiSeq高通量測序數據下機后根據重疊關系將序列的雙端序列進行拼接,并進行序列質量控制[14],將拼接過程中不合格的序列刪除,獲取高質量序列。通過QIIME(V1.9.1)平臺對獲取的高質量序列進行真菌群落注釋和多樣性分析,具體流程:(1)去除嵌合體序列[15];(2)按照97%相似度結合UNITE數據庫進行序列的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分和物種注釋[16-17];(3)計算樣品中α多樣性指數[18]。

1.3.4 樣品理化指標的測定

參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》對中溫大曲樣品的水分含量、酸度、淀粉含量、發酵力、液化力、糖化力、酯化力、灰分、氨基酸態氮和酒化力進行測定,使用水分活度測定儀進行樣品中水分活度的測定,使用凱氏定氮儀對樣品中含氮量進行測定,從而計算樣品中蛋白質含量。

1.3.5 樣品中酵母菌的分離純化與鑒定

霉菌和酵母計數:參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》中平板計數法進行大曲樣品中菌落計數,依照菌落計數原則計算樣品中霉菌和酵母菌的菌落數。

酵母菌的分離純化:5份中溫大曲等量混合均勻取樣,用0.85%的無菌生理鹽水對樣品進行梯度稀釋,選擇合適梯度的稀釋液100 μL涂布于PDA固體平板上,28 ℃培養3～5 d后挑取菌落形態和顏色不同的單菌落進行純化,并使用30%的甘油保藏菌體。

酵母菌的鑒定:參考CHOW等[19]研究并略做調整對樣品中分離株進行DNA提取和ITS區擴增,經過清潔、連接和轉化操作后將陽性單克隆產物送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序,對反饋回的序列進行引物的查找與去除后在GenBank數據庫進行Blast同源性比對,明確其微生物學地位。

1.3.6 核酸登錄號申請

本研究5份中溫大曲高通量測序數據已提交至MG-RAST數據庫申請核酸登錄號,ID號為mgp104048。

1.3.7 數據處理和可視化分析

經生物信息學分析后在Excel 2021中進行數據可視化處理和表格繪制,使用在線繪圖工具jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)繪制韋恩(Venn)圖,利用Spearman相關性分析進行優勢真菌屬與理化特性指標間的相關性分析,使用R-4.1.3軟件繪制瀑布圖、堆積柱狀圖和相關性熱圖,利用MEGA7構建樣品中分離株的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據統計及質量評估

采用Illumina MiSeq測序技術對采集自河套地區的5份中溫大曲進行真菌群落結構分析,測序后的原始序列經過拼接和質量控制篩選出優質序列,并對其進行數據統計,結果如表1所示。

表1 樣品ITS基因測序數據統計

由表1可知,本次測序共得到高質量序列293 433條,劃分為2 100個OTU,平均每個樣品含有58 686條序列。α多樣性指數可以有效評估樣品中微生物的豐度和多樣性,香農指數又稱為多樣性指數,用以衡量樣品中物種類群的多少,超1指數又稱為豐富度指數,用以衡量樣品中物種數量的多少。其中,樣品HT4香農指數最大,樣品HT3超1指數最大,表明樣品HT4中物種類群最多,樣品HT3中物種數量最多。

2.2 不同中溫大曲樣品中OTU分析

為解析大曲中真菌群落結構,本研究對樣品中OTU分布進行可視化分析,在所有樣品中均存在的OTU被稱為核心OTU。由圖1-A可知,本研究的5份中溫大曲樣品中核心OTU數有61個,包含239 613條序列,占總序列數的81.66%,且平均相對含量>1%的核心OTU有5個。

A-韋恩圖;B-瀑布圖

為進一步明確核心OTU的分布情況和分類學地位,本研究對平均相對含量>1%的核心OTU進行分析。由圖1-B可知,平均相對含量>1%的核心OTU包括OTU1929(嗜熱真菌屬,Thermomyces)、OTU2005(曲霉屬,Aspergillus)、OTU2178(雙足囊菌屬,Dipodascus)、OTU2411(酵母菌目,Saccharomycetales)和OTU710(Rhizomucor),累積平均相對含量達77.15%。2.3 不同中溫大曲樣品中真菌群落結構分析

為進一步分析不同中溫大曲樣品間的差異性,本研究基于真菌門和屬水平解析不同樣品中群落結構,對樣品中平均相對含量>1%的優勢真菌門和屬進行可視化分析,結果如圖2所示。

A-優勢真菌門;B-優勢真菌屬

由圖2-A可知,中溫大曲樣品中優勢真菌門主要隸屬于Ascomycota、Mucoromycota和擔子菌門(Basidiomycota),平均相對含量分別為81.24%、10.22%和8.15%,與襄陽地區中溫大曲中真菌群落結構相似[20]。由圖2-B可知,樣品中優勢真菌屬有7個,分別隸屬于Thermomyces(60.08%)、Aspergillus(13.37%)、節擔菌屬(Wallemia,7.76%)、橫梗霉屬(Lichtheimia,6.63%)、Rhizomucor(2.79%)、Dipodascus(1.69%)和Rhizopus(1.02%),占總測序量的93.36%。根據可視化分析結果顯示,不同樣品中真菌群落豐度和多樣性存在一定差異,與表1中α多樣性分析結果基本一致。

2.4 樣品中優勢真菌與理化指標的相關性分析

依據1.3.4節對5份中溫大曲樣品的理化指標進行測定,其結果如表2所示。

表2 樣品中理化指標的分析

由表2可知,在糖化力指標上樣品平均值為528.56 U,標準差為141.98,在酯化力指標上樣品平均值為534.41 U,標準差為210.99。樣品間糖化力和酯化力數值波動較大,這可能與本研究中溫大曲的貯存期較長有關[21],且樣品HT2糖化力和酯化力最小。尉嘉眙等[22]對不同類大曲的理化性質與白酒產品風味進行分析發現,大曲的發酵力與正丙醇呈顯著正相關(P<0.05),酯化力與β-苯乙醇和乙醛、液化力與總酸總酯呈顯著負相關(P<0.05)。MA等[23]對濃香型大曲發酵過程中微生物群落演替進行研究發現,細菌群落演替的主要驅動因素是酸度、濕度和溫度,真菌群落演替的主要驅動因素是水分,據此推測大曲中水分含量可能與真菌群落之間存在相關性。

為進一步深入探究中溫大曲樣品中優勢真菌屬與理化指標的相關性,本研究使用Pearsom系數法對7個優勢真菌屬和12個理化指標進行可視化相關性分析,結果如圖3所示。

由圖3可知,優勢真菌屬與中溫大曲理化酶活性(糖化力、液化力、發酵力、酯化力)和水分含量之間具有顯著相關性,Lichtheimia與大曲液化力(r=0.937,P<0.05)和糖化力(r=0.932,P<0.05)均呈顯著正相關性,Dipodascus與大曲液化力(r=0.929,P<0.05)和水分含量(r=0.898,P<0.05)正相關性顯著,且與大曲糖化力呈極顯著正相關(r=0.981,P<0.01),Wallemia與大曲發酵力正相關性顯著(r=0.881,P<0.05),Rhizomucor與大曲酒化力呈顯著負相關(r=-0.928,P<0.05)。欒春光等[24]對清香型大曲研究顯示,Lichtheimia與清茬曲的酯化力提升密切相關。杜向軍等[25]通過對大曲微生物群落結構及關鍵影響因素研究顯示,Rhizomucor是影響大曲糖化力、液化力和酒化力的主要微生物之一。HE等[9]分析亦顯示,糖化力與濃香型大曲中Rhizomucor呈現正相關。唐鰻秋等[26]對8種中日酒曲進行分析可知,酒曲種群結構與其理化指標存在明顯相關性,其中Aspergillus與水分、糖化力、液化力、酸度和還原糖呈正相關,與發酵力呈負相關,且發酵力和液化力對微生物物種分布影響最大。

2.5 中溫大曲樣品中酵母菌分析

本研究參考國標對5份中溫大曲樣品進行霉菌和酵母菌計數,樣品中霉菌和酵母菌總數在1.41×105～2.88×106CFU/g。將采集樣品等量混合均勻后通過傳統微生物技術進行大曲中酵母菌的分離,其菌落形態和顯微鏡形態如圖4所示。

A-分離株菌落形態;B-顯微鏡形態

由圖4可知,兩株分離株的菌落形態和顯微鏡形態相似,菌落呈乳白色、有光澤、較平坦、邊緣整齊,分離株細胞呈橢圓形或圓筒形。

為進一步明確分離株的分類學地位,對分離株進行ITS區PCR擴增與鑒定,分離株序列在數據庫中經過同源性分析獲取可靠信息,其與標準菌株之間的同源性分析如圖5所示。

圖5 樣品中分離株系統發育樹

由圖5可知,分離株HBUAS61816和HBUAS61817與標準菌株S.fibuligeraATCC 36309和S.fibuligeraNRRL Y-2388之間同源性均達到100%。由此可知,本研究中分離株HBUAS61816和HBUAS61817隸屬于S.fibuligera。

根據霉菌和酵母菌總數測定結果顯示,樣品中含有豐富的可培養霉菌和酵母菌。霉菌、酵母菌和細菌作為大曲中3種重要菌群,在白酒釀造中發揮著重要作用,其中霉菌作為糖化動力,酵母菌作為發酵動力,細菌作為生香動力,相輔相成,對白酒的發酵及風味的產生具有重要意義。PU等[27]使用接種酵母菌的強化大曲進行白酒釀造,發現強化大曲釀造的白酒其風味物質含量更高,感官評分更佳。YI等[28]研究表明,曲霉和青霉等真菌為醬香大曲中活性最強的微生物,能表達與芳香類化合物降解相關的功能酶,在白酒香氣前體物質形成中具有不可忽視的作用。因此在后續研究中采用“培養組學”策略[29],進一步挖掘其中的微生物資源,解析大曲中真菌群落自發式構建機制,探究其對白酒品質的影響十分必要。

3 結論

本研究采集自河套地區的中溫大曲主要真菌微生物,主要隸屬于Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota,且不同樣品間真菌群落組成和多樣性存在差異。大曲中優勢真菌屬Thermomyces、Aspergillus、Wallemia、Lichtheimia、Rhizomucor、Dipodascus、Rhizopus與理化指標間存在一定相關性,其中優勢菌屬與大曲水分含量和理化酶活性之間均呈現顯著相關性。S.fibuligera是大曲樣品中主要的酵母菌分離株。