代謝工程改造畢赤酵母生產赤蘚糖醇

趙思佳 王曉璐 孫紀錄 田健 張杰

（1. 河北農業大學食品科技學院，保定 071000；2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室，北京 100193）

赤蘚糖醇（erythritol）在自然界中分布廣泛，是一種天然甜味劑、滲透保護劑。它存在于梨、葡萄等水果，蘑菇、甜菜等蔬菜，啤酒、清酒等飲料，醬油等發酵食品，海藻以及人和動物體液中［1]。赤蘚糖醇的口感、質地與蔗糖相似，甜度為蔗糖的60%-80%，熱量僅為蔗糖的5%，在多元醇中對動物機體的副作用最小［2-4]。赤蘚糖醇能被小腸快速吸收，但90%不參與人體代謝，且與尿液一起排出體外，不改變體內血糖和胰島素水平，被認為是一種零熱量、安全性高的甜味劑，受到了糖尿病患者和減肥人群的青睞。除了作為功能性甜味劑外，赤蘚糖醇還有一定的抗氧化特性，可作為自由基清除劑［5]。此外，它還具有保護肝臟、吸濕性低、熱穩定性好、溶解熱低、耐受量高、防齲齒、加工特性優良等特點［6]。目前，赤蘚糖醇被廣泛應用于食品、醫藥、化工及化妝品等領域，用于制作牙膏、無糖食品、飲品、保健品以及藥品［7]。據預測，2023年全球赤蘚糖醇的年產值可達1.5億美元，相比2017年提升了1.9倍［8]。

天然的蔬菜、水果中赤蘚糖醇的含量太低，直接提取的成本較高，故赤蘚糖醇的生產方法主要是化學合成法和微生物發酵法［9]。化學合成法包括用金屬或金屬氧化物催化、用阿拉伯酸或核糖酸電解脫羧等方法，但這些反應過程需要高溫、高壓，生產成本高昂［10]。微生物發酵法主要是用真菌進行發酵生產赤蘚糖醇，此外一些細菌如酒球菌（Oenococcus oeni）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等也可以生產少量赤蘚糖醇［11-13]。目前，被用于生產赤蘚糖醇的菌屬有：耶氏酵母屬（Yarrowia）、假絲酵母屬（Candida）、圓酵母屬（Torula）、假酵母屬（Pseudozyma）、叢梗孢酵母屬（Moniliella）等［14]。常用的酵母菌包括叢梗孢酵母（Moniliella pollinis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、球頭三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）等［15]?；贛.pollinis細胞裂解物的培養基可以使乙醇轉化為赤蘚糖醇，從而提高赤蘚糖醇總產量，在甘蔗汁補料分批發酵M. pollinis時，獲得了最大滴度為94.9 g/L的赤蘚糖醇［16]。以粗甘油為原料、Y. lipolytica野生型為底盤菌株，探究提高赤蘚糖醇產量的方法，研究發現單獨過表達GUT1的突變株GUT1表達量可以提高11倍，由于基因的協調作用，同時，過表達GUT1、GUT2粗甘油同化可以提高1/3。過表達TKL1的菌株赤蘚糖醇效價比對照菌株增加了48.1%，說明編碼轉酮醇酶的TKL1對于赤蘚糖醇的合成起了重要作用。過表達GUT1、GUT2和TKL1，敲除EYD1是生產赤蘚糖醇的最佳組合，根據此組合獲得的突變株Y-11在5 L生物反應器中赤蘚糖醇產量達到了150 g/L［17]。以T. oedocephalis為底盤菌株，敲除HOG1后在200 g/L葡萄糖和0.3%檸檬酸條件下發酵120 h，得到（69.12±0.19）g/L赤蘚糖醇，但當檸檬酸濃度增加到0.4%時，赤蘚糖醇的產量降低，說明較高濃度的檸檬酸可能會抑制細胞生長并影響代謝［18]。

甲基營養酵母畢赤酵母（Pichia pastoris）易于遺傳操作、在葡萄糖和甘油上能夠快速生長、可以高細胞密度發酵以及在細胞內、外產生高水平異源蛋白質的能力使它成為一種有吸引力的多功能底盤細胞［19]。近年來，P. pastoris已被廣泛用作生產各種高價值生物活性化合物的高效細胞工廠，包括蘋果酸［20]、脂肪酸［21]、肌醇［22]等。P. pastoris作為一種耐高滲酵母菌，具有高產赤蘚糖醇的潛力，但目前還沒有赤蘚糖醇在P. pastoris中合成的相關報道。

本研究以P. pastoris GS115為出發菌株構建赤蘚糖醇細胞工廠，分析糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑碳代謝流改造及4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶、糖醇磷酸酶、赤蘚糖還原酶的過表達對P. pastoris中赤蘚糖醇生產的影響，同時利用生物信息學結合代謝工程技術研究副產物阿拉伯糖醇和核糖醇合成關鍵基因，為高產赤蘚糖醇P. pastoris工程菌株構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用菌株及質粒見附表1。所用引物均由擎科生物合成（附表2）。

表2 突變株C5高密度發酵產物Table 2 Products of high-density fermentation of mutant C5

1.2 方法

1.2.1 基因組編輯載體的構建 為了構建生產赤蘚糖醇的P. pastoris菌株，并提高其產量，試驗弱化了P. pastoris自身的果糖-6-磷酸激酶I基因pfk1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（PAS_chr2-1_0437）；敲除了果糖-6-磷酸激酶II基因pfk2，合成阿拉伯糖醇和核糖醇的基因PAS_chr2-2_0019、PAS_chr4_0988、PAS_chr4_0754和PAS_chr1-1_0490；過表達自身轉酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的核酮糖-3-磷酸差向異構酶基因rpe1和去磷酸化酶基因pyp1，來源于E. coli的去磷酸化酶基因yidA，來源于里氏木霉（Trichoderma reesei）的赤蘚糖還原酶基因err1，來源于Y. lipolytica的NADH依賴型以及木蘭假絲酵母（Candida magnoliae）的NADPH依賴型赤蘚糖還原酶基因er，經過組合，共構建了7個基因組編輯質粒（附表1）。

P. pastoris基因組編輯質粒的構建參照前期已經建立的方法［22]。以重組質粒p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1的構建為例：以P. pastoris GS115基因組為模板，擴增aox兩側各1000 bp左右的DNA序列作為上下游同源臂，將上游同源臂與p19-3-1質粒連接，通過PCR及overlap PCR獲得small arm-Pgap1-pyp1-down arm片段，利用同源重組試劑盒將該片段與p19-3-1-up-arm質粒連接，即獲得p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1重組質粒。其他基因組編輯質粒的構建與之類似，不再贅述。

1.2.2 重組畢赤酵母菌株的構建 共構建11個重組P. pastoris菌株。P. pastoris工程菌構建分為兩部分：目的片段的敲入和抗性基因的敲除。構建方法參考文獻［22]，簡述如下：

目的片段的敲入。利用限制性內切酶Not I酶切載體，將線性化的重組質粒轉化P. pastoris菌株，經30℃、30 min復蘇后，將轉化后的菌液涂布于含Zeocin抗性的BMGY培養基，30℃倒置培養48 h。待單克隆出現后，利用克隆PCR和測序的方法驗證目的片段的敲入情況。

抗性基因的敲除。選取成功整合目的片段的菌株進行甲醇誘導，通過mazF毒性基因的表達結合同源重組將抗性標簽敲除。甲醇誘導體系：5 mL YNB、45 mL ddH2O和500 μL甲醇。30℃誘導，每24 h補加500 μL甲醇。誘導2-3 d后的菌液梯度稀釋涂布BMGY培養基，利用克隆PCR和測序的方法驗證抗性標簽的去除情況。

1.2.3 外源基因在畢赤酵母中的表達 為了快速篩選外源基因，采用構建游離質粒，電轉化P. pastoris的方法，驗證外源基因是否表達?；A表達質粒T-ARS-PGAP是在T載體的基礎上構建，含有能在P. pastoris中自我復制的ARS（autonomously replicating sequence）復制子，組成型強啟動子PGAP，用于純化的His標簽，Ampicillin、Zeocin抗性標記以及預留的多個酶切位點。篩選的目的基因包括來源于S. cerevisiae的pyp1，來源于T. reesei的err1，來源于Y. lipolytica的er（NADH）、ER10、ER25和JX885，來源于C. magnoliae的er（NADPH），來源于M. megachiliensis的er1、er3，經密碼子優化后，由北京六合華大基因科技有限公司合成。yidA和rpe1分別以E. coli和S. cerevisiae的基因組為模板擴增獲得。目的基因刪除終止密碼子，經過PCR擴增后，利用同源重組試劑盒連接到T-ARS-PGAP載體的Hind III和Xho I酶切位點，獲得這些基因的表達載體（附表1）。

將含有目的基因的表達載體轉化P. pastoris C0菌株，挑取單克隆轉化子，30℃培養24 h。選擇生長旺盛的菌株接種于50 mL BMGY培養基培養24 h，然后，按2%接種量轉接于200 mL BMGY培養基，30℃、200 r/min培養48 h。將菌液于5000 r/min離心，獲得菌體，經液氮研磨，用10 mL Tris-HCl（pH 7.4）重懸，12000 r/min離心10 min，取上清。含His標簽的蛋白通過磁珠法純化（His-tag蛋白純化磁珠，海貍公司），進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 搖瓶發酵與高密度發酵 挑取正確的單克隆接種于50 mL BMGY生長培養基中，30℃培養48 h，制作發酵種子液。搖瓶發酵在含有200 mL低鹽發酵培養基的錐形三角瓶（1 L）中進行，培養溫度30℃，搖床轉速200 r/min，每個菌株設置3個平行。高密度發酵在含有7 L低鹽發酵培養基的發酵罐（10 L）中進行，溫度30℃，溶氧量30%，菌株生長前期以甘油為碳源，控制pH 4.5。當細胞濕重達到180-200 mg/mL時，碳源換為葡萄糖，將菌株的狀態由生長轉換為生產。

1.2.5 產物含量的檢測 采用高效液相色譜法（HPLC）檢測發酵液中的赤蘚糖醇、葡萄糖、阿拉伯糖醇、核糖醇等化合物的含量。1 mL發酵液經12000 r/min離心3 min，用0.22 μm濾器過濾上清，取200 μL置于內插管中，4℃保存待測。檢測儀器為示差折光檢測器，色譜柱型號Agilent Hi-Plex Ca（7.7 mm×300 mm，8 μm），流動相為超純水，流速為0.5 mL/min，柱溫80℃。

2 結果

2.1 弱化糖酵解途徑

細胞從外界吸收葡萄糖，經過磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其中一部分進入戊糖磷酸途徑，另一部分進入糖酵解途徑進行代謝。為了使更多的葡萄糖-6-磷酸進入戊糖磷酸途徑，進而流向赤蘚糖醇的前體物質——赤蘚糖-4-磷酸，試驗首先對糖酵解途徑進行了弱化。進入糖酵解途徑的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸異構酶異構化生成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶作用下生成果糖-1,6-磷酸，隨后，在醛縮酶的作用下生成甘油醛-3-磷酸（圖1）。已知P. pastoris中起作用的磷酸果糖激酶有磷酸果糖激酶I（PFK1,GenBank：PAS_chr2-1_0402）和磷酸果糖激酶II（PFK2,GenBank：PAS_chr2-1_0047）。

圖1 畢赤酵母中赤蘚糖醇合成通路的構建Fig. 1 Construction of erythritol biosynthetic pathway in P. pastoris

據報道，pfk1、pfk2在P. pastoris中均可實現單獨敲除，但不能同時敲除，不論敲除順序如何，均不能得到pfk1、pfk2雙敲菌株，因此，選擇在pfk2敲除的菌株P. pastoris C1中弱化pfk1。在P. pastoris中，甘油的利用受到葡萄糖的抑制，而抑制作用主要是由于甘油代謝的第一步基因——甘油激酶基因（gut1）的表達受到調控所致。因此，選擇利用甘油激酶基因的啟動子Pgut1替換了C1菌株中pfk1的啟動子，以期利用碳代謝抑制（carbon catabolite repression，CCR）的原理調控糖酵解的代謝流，成功獲得菌株P. pastoris C2。

對獲得的突變株P. pastoris C2及對照菌株C0進行搖瓶發酵。菌株首先利用發酵培養基中的甘油為唯一碳源生長24 h，之后補加50 g/L葡萄糖繼續發酵。由圖2-A可以看出，2株菌在前24 h生長基本一致，說明以甘油為碳源時，C2菌株的Pgut1-pfk1正常表達。在培養基中補加葡萄糖后，C2的生長明顯慢于對照菌株C0，發酵72 h時，C2的OD600僅為C0的2/3。由此可見，敲除pfk2并用Pgut1控制pfk1的表達，以葡萄糖為碳源時減弱了C2的糖酵解途徑，抑制了菌株生長。同時，發酵結果顯示，菌株C2在搖瓶發酵過程中產生了副產物——阿拉伯糖醇和核糖醇（圖2-B）。2個副產物均來自戊糖磷酸途徑，說明C2的戊糖磷酸途徑的代謝流得到加強。但副產物的產生會影響目標產物的生產，并對目標產物的分離純化造成困擾，因此，消除和降低副產物也是本研究的重要內容。

圖2 畢赤酵母菌株C0和C2的表型驗證Fig. 2 Phenotype verification of P. pastoris C0 andC2 strains

2.2 副產物合成關鍵基因的敲除

根據搖瓶發酵結果，已知C2菌株發酵過程中的主要副產物為阿拉伯糖醇和核糖醇。通過KEGG、NCBI等數據庫分析發現，與這兩個副產物合成相關的糖醇脫氫酶基因主要有3個：0019（GenBank：PAS_chr2-2_0019）、0754（GenBank：PAS_chr4_0754）和0988（GenBank：PAS_chr4_0988）。其中，0754和0988在P. pastoris基因組上的位置相近。通過同源重組的方法將3個基因依次敲除，得到突變株P. pastoris C3（Δ0019）和C4（Δ0019Δ0988Δ0754）。

對C3和C4突變株進行搖瓶發酵。結果（圖3）顯示，敲除0019使C3的核糖醇產量相比C2降低了58.6%。由于核糖醇和阿拉伯糖醇來自于同一個前體物核酮糖-5-磷酸，因此C3的阿拉伯糖醇產量有所升高。進一步敲除0988和0754后，C4的阿拉伯糖醇產量相比C2降低了95.6%，而對應的核糖醇產量有所提升。由此可見，0019主要催化核糖醇的生產，而0988和0754主要介導阿拉伯糖醇的生產。C3和C4突變株的副產物總產量（阿拉伯糖醇和核糖醇之和）分別為5.6和1.9 g/L，相比C2菌株（6.2 g/L）分別降低了6.7%和69.4%。

圖3 畢赤酵母菌株C2、C3、C4阿拉伯糖醇和核糖醇的生產Fig. 3 Production of arabitol and ribitol by P. pastoris C2,C3 and C4 strains

2.3 構建赤蘚糖醇合成通路

赤蘚糖醇合成的前體物是來自戊糖磷酸途徑的赤蘚糖-4-磷酸。在真菌中，赤蘚糖-4-磷酸首先去磷酸化生成赤蘚糖，然后在赤蘚糖還原酶的作用下還原成赤蘚糖醇。在細菌中，赤蘚糖-4-磷酸則先被赤蘚糖醇-4-磷酸脫氫酶還原成赤蘚糖醇-4-磷酸，再通過磷酸酶作用生成赤蘚糖醇。本研究選擇前一條通路，在P. pastoris中構建赤蘚糖醇合成途徑。

2.3.1 赤蘚糖還原酶基因的篩選與外源基因的表達 選取不同來源的赤蘚糖還原酶基因（表1）［23-25]。將選取的赤蘚糖還原酶基因以及本研究中所涉及的其他外源基因與含有His標簽的過表達載體連接（圖4-A），并轉入P. pastoris驗證其表達情況。結果顯示，4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因yida，赤蘚糖還原酶基因err1、er（NADH）和er1，糖醇磷酸酶基因pyp1及磷酸核酮糖差向異構酶基因rpe1能在P. pastoris中表達（圖4-B），因此，選擇這些基因在P. pastoris中構建赤蘚糖醇合成通路。

圖4 外源基因在畢赤酵母中表達Fig. 4 Expressions of exogenous genes in P. pastoris

2.3.2 構建畢赤酵母赤蘚糖醇合成通路 首先在P. pastoris中敲入赤蘚糖還原酶基因，即過表達Y.lipolytica來源的依賴于NADH的赤蘚糖還原酶基因er（NADH），探究在P. pastoris自身含有的磷酸酶基因以及敲入的赤蘚糖還原酶基因的作用下能否生產赤蘚糖醇。

經過基因組編輯，在C4菌株中整合了PGAP-er（NADH）表達框獲得菌株C5。高密度發酵結果顯示，C5突變株的發酵液中沒有赤蘚糖醇的積累（表2）。猜測可能有兩個原因造成了這個現象：（1）前體物赤蘚糖-4-磷酸供給不足；（2）P. pastoris自身的磷酸酶不能將赤蘚糖-4-磷酸轉化成赤蘚糖，需要表達外源磷酸酶基因。因此，選擇對糖酵解中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPD，GenBank：PAS_hr2-1_0437）進行弱化，使更多的碳代謝流留在戊糖磷酸途徑。

將C4菌株的GAPD啟動子替換成Pgut1啟動子，獲得菌株C6。S. cerevisiae來源的糖醇磷酸酶PYP1可以催化赤蘚糖醇-4-磷酸水解為赤蘚糖醇，因此，在菌株C6中過表達經密碼子優化后的pyp1，獲得菌株C7。然而，結果顯示，突變株C7并沒有獲得生產赤蘚糖醇的能力。在過表達pyp1的基礎上，選擇再整合表達來源于E. coli的4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因yidA，構建了菌株C8。結果顯示，C8突變株的生物量相比出發菌株有一定的降低（圖5-A），發酵液中生產了約30 mg/L的赤蘚糖醇（圖5-B）。另外，副產物阿拉伯糖醇和核糖醇也有一定的積累圖5-C）。

圖5 畢赤酵母菌株C0和C8的表型驗證Fig. 5 Fermentation profiles of P. pastoris C0 and C8 strains

2.4 強化戊糖磷酸途徑

在Y. lipolytica中，過表達戊糖磷酸途徑關鍵酶轉酮酶基因TKL可以提高赤蘚糖醇的生產［26]。并且根據KEGG數據庫分析，P. pastoris GS115菌株中缺少磷酸核酮糖差向異構酶基因rpe。因此，選擇過表達S. cerevisiae來源的rpe1以及P. pastoris自身的轉酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），使更多的葡萄糖-6-磷酸流向赤蘚糖醇的前體物質——赤蘚糖-4-磷酸，從而達到提高赤蘚糖醇產量的目的。

在過表達pyp1和yidA菌株的基礎上，又整合了PGAP-rpe1和PGAP-TKL1表達框，構建了菌株C10。搖瓶發酵結果由圖6所示，菌株C0與C10的生長接近，C10的赤蘚糖醇產量達到1.2 g/L，相比C8提高了約40倍。C10的發酵液中并沒有檢測到阿拉伯糖醇的生產，但核糖醇達到10.0 g/L，相比C8也大幅提升。

圖6 畢赤酵母菌株C0和C10的表型驗證Fig. 6 Phenotype verification of P. pastoris C0 and C10 strains

搖瓶發酵由于不能控制溶氧和pH，無法真正反映菌株的生產潛力，因此，使用10 L發酵罐對C10菌株進行了高密度發酵。發酵初期以甘油為碳源，待菌體生長至濕重約180 mg/mL后流加70%葡萄糖進行補料發酵，流加葡萄糖72 h后發酵結束。HPLC分析結果（圖7）顯示，突變菌株C10赤蘚糖醇產量為10.6 g/L，副產物阿拉伯糖醇7.5 g/L，核糖醇8.7 g/L。

圖7 畢赤酵母菌株C10高密度發酵Fig. 7 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C10

2.5 過表達赤蘚糖還原酶對赤蘚糖醇產量的影響

赤蘚糖還原酶可催化赤蘚糖生成赤蘚糖醇，是赤蘚糖醇合成途徑的最后一步催化酶，其活性對赤蘚糖醇的生產尤為關鍵。根據不同來源的赤蘚糖還原酶在P. pastoris中的表達情況（圖4-B），選擇來源于Y. lipolytica的依賴于NADH的er（NADH）和來源于T. reesei的依賴于NADPH的err1進行過表達［27-28]。2個基因使用PGAP作為啟動子整合到了C10菌株的基因組上，分別得到突變株C11（PGAPerr1）和C12（PGAP-er（NADH））。對C11、C12菌株進行搖瓶發酵（表3）。C11和C12的赤蘚糖醇產量均為1.2 g/L，與C10的搖瓶發酵產量一致。C10菌株在搖瓶發酵中沒有檢測到阿拉伯糖醇，而C11和C12的阿拉伯糖醇產量分別達到4.9和5.1 g/L，說明過表達的2個還原酶對核酮糖底物也可能具有一定的還原活性，因此，造成了阿拉伯糖醇產量的提升。

表3 突變株C11和C12搖瓶發酵產物Table 3 Products of shake-flask fermentation of mutant C11 and C12

對副產物含量較少的菌株C11進行了高密度發酵（圖8）。C11高密度發酵的濕重最高可達320.0 mg/mL，赤蘚糖醇在發酵過程中一直積累，發酵結束時產量僅為2.1 g/L，相比C10的高密度發酵有較大幅度的降低。副產物阿拉伯糖醇和核糖醇產量達到了17.9和18.5 g/L，相比C10的高密度發酵有很大程度的提高，再次說明在P. pastoris中過表達赤蘚糖還原酶對赤蘚糖醇的生產具有負面作用。

圖8 畢赤酵母菌株C11高密度發酵Fig. 8 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C11

3 討論

在過去的幾十年里，P. pastoris已經進行了許多成功的糖基化研究，使這種甲基營養酵母成為最常用的蛋白質，特別是人源蛋白質表達酵母宿主之一［29]。P. pastoris已被用于在工業水平上生產各種重組蛋白產品，包括微生物蛋白、酶和生物制藥蛋白［30]。近期，它被報道用于合成高價值的生物活性物質。在P. pastoris中融合表達LevB1、SacB兩個酶，1.5 L生物反應器水平下，從160 g蔗糖可以獲得72.9 g不含單糖的Levan型低聚果糖［31]。應用糖基磷脂酰肌醇錨定系統，將β-葡萄糖苷酶BGL、內切葡聚糖酶EG、纖維二糖水解酶CBH共同展示在P. pastoris表面，結合SPI1啟動子和分泌信號序列進一步增強細胞表面纖維素酶活性，獲得能將磷酸溶脹纖維素水解為葡萄糖的P. pastoris菌株，在此基礎上表達丙酮酸裂解酶UbiC，進行96 h分批發酵，該菌株從磷酸溶脹纖維素產生了975 mg/L 4-羥基苯甲酸，產量比以葡萄糖為底物高2倍以上［32]。通過聯合過表達ZWF1和SOL3提高NADPH供應，過表達腺嘌呤磷酸核糖轉移酶增強AMP供應，低強度表達NADH激酶POS5，敲除NADH依賴性二羥基丙酮磷酸還原酶得到P. pastoris X33-38菌株。經過72 h搖瓶發酵產生了3.09 g/L α-法尼烯，產量比出發菌株高41.7%［33]。近幾年研究表明，P. pastoris是性狀優良的高價值生物活性物質生產平臺。

P. pastoris的眾多優勢是選擇它作為生產赤蘚糖醇的宿主細胞的原因，但在本研究開展的過程中也發現以該菌株作為底盤細胞生產高價值化合物時存在一些缺點，特別是應用代謝工程的方法改造P.pastoris生產赤蘚糖醇的過程中，伴隨著大量副產物的產生。P. pastoris是耐滲透酵母，當培養環境中糖濃度較高時，會通過產生一些物質維持滲透壓平衡。經過弱化糖酵解途徑，增加戊糖磷酸途徑的碳流量，發酵產物中出現了副產物阿拉伯糖醇和核糖醇。根據之前的報道，包括核糖醇和阿拉伯糖醇在內的一些糖醇化合物是酵母菌的滲透調節劑［14]。通過調節細胞滲透壓，向培養基中添加一定量的NaCl能夠將Y. lipolytica的副產物甘露醇和阿拉伯糖醇分別減少46%和30%［17]，也可以說明產生滲透調節劑是酵母菌的應激反應。盡可能地敲除副產物合成途徑且不產生新的副產物是代謝工程改造菌株研究中的一個重要部分。本研究選擇了產生核糖醇和阿拉伯糖醇的關鍵基因并對其進行敲除，副產物產量明顯下降，且沒有新的副產物生成。戊糖磷酸途徑中關鍵酶的活性對赤蘚糖醇的生產至關重要，核糖醇和阿拉伯糖醇等副產物的產生也說明P. pastoris中核酮糖-5-磷酸的轉化受到了一定的限制。因此，本研究選擇過表達S. cerevisiae來源的3-磷酸核酮糖差向異構酶rpe1以及轉酮醇酶TKL1，使更多的碳源流向產物。根據先前的報道，來源于Y. lipolytica和T. reesei的赤蘚糖還原酶對赤蘚糖具有較高的催化活性，但同時對其他底物，如阿拉伯糖、果糖等也有一定的活性［27-28]，而且不同來源的赤蘚糖還原酶的底物特異性也有所不同。本研究選擇過表達這兩個酶進一步提高赤蘚糖醇產量，但是結果顯示赤蘚糖醇的合成并未提升，反而造成了阿拉伯糖醇產量的提高，因此，推測這兩個酶可能對核酮糖也有一定還原活性，后續研究將對具有專一性的赤蘚糖還原酶進行探索。傳統的發酵方法是利用游離的菌體通過發酵獲得產品，有研究將細胞固定化的方法應用到生產赤蘚糖醇中，通過將底盤細胞M. pollinis固定在2 L生物反應器內，96 h生產了47.03 g/L赤蘚糖醇，實現了細胞固定化生產赤蘚糖醇［34]。在后續的工作中可以嘗試將此方法用于P. pastoris或其他酵母菌株來生產赤蘚糖醇以及更有價值的化合物。

4 結論

以P. pastoris為底盤細胞構建了赤蘚糖醇合成通路，弱化糖酵解途徑關鍵基因，敲除阿拉伯糖醇和核糖醇等副產物生產相關基因，過表達糖醇磷酸酶和4-磷酸赤蘚糖磷酸化酶基因有利于赤蘚糖醇的生產。強化戊糖磷酸途徑關鍵酶轉酮酶和磷酸核酮糖差向異構酶的表達，大幅提高了赤蘚糖醇的產量。最優菌株在搖瓶和高密度發酵中赤蘚糖醇的產量分別達到1.2和10.6 g/L。

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