一株Olivibacter jilunii 纖維素降解菌株的分離鑒定與降解能力分析

饒紫環 謝志雄

（武漢大學生命科學學院，武漢 430000）

木質纖維素是自然界中含量最豐富的有機物，主要由木質素、纖維素和半纖維素組成。木質纖維素的生物處理一直被認為是解決化石燃料短缺問題的有效方法，也是未來新能源開發的趨勢。木質纖維素的生物處理通常使用降解木質纖維素的酶，包括木質素酶、纖維素酶和半纖維素酶。其中纖維素酶主要應用于造紙業、洗滌劑、食品、工業生產酒精等領域［1-2]，約占全球工業酶需求的8%［3]。針對不同的產業和目的，采用的纖維素酶種類也不同。盡管目前關于纖維素酶的研究不斷取得進展，酶產品的成本仍然居高不下。篩選新型纖維素酶對相關工業的發展有著至關重要的作用。

纖維素酶根據作用位點，可以大致分為外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等［4]。外切葡聚糖酶主要作用于纖維素結晶區，終產物可以是葡萄糖或者纖維二糖。內切葡聚糖酶主要作用于纖維素無定形區，隨機切割產生新的末端，產物是一些不定長度的寡糖。β-葡萄糖苷酶更傾向作用于非還原端，水解纖維糊精和纖維二糖產生葡萄糖。纖維素酶主要來源于纖維素降解菌株。其中真菌是研究最多的一類纖維素降解微生物。一般認為真菌的纖維素分解能力和酶活性普遍高于細菌，然而真菌的高酶活可能是源于其較強的蛋白分泌能力［5]，若具體到單酶的活性，細菌產生的酶可能會更適用于工業生產［4]。同時由于真菌酶系更為復雜，在純化單酶時面臨更多的技術問題。因此近年來相關研究更多集中于得到具有降解能力的細菌［1]。適應極端環境的細菌，如嗜熱、耐堿等方向尤為受到關注。然而日常工農業生產活動更多的是在常溫下進行，常溫纖維素降解菌株有著更廣闊的應用前景。不斷篩選鑒定發現新型常溫纖維素降解菌株對充實相關微生物資源有著重要意義，也為新型纖維素酶的研發提供了更多的思路。

Olivibacter屬最早發現于2007年［6]，模式菌株為 Olivibacter sitiensis AW-6T，因在橄欖油廢料中分離得到而得名。該屬的典型特征為棒狀，革蘭氏染色陰性。Olivibacter屬內迄今為止已有10個已鑒定的新種，其中Olivibacter jilunii 14-2AT于2013年從DDT污染土壤中分離得到［5]。

由于纖維素降解菌株主要富集在纖維素豐富的環境中，因此本研究從園林堆肥中選取分離基質，設計篩選培養基，得到常溫下的纖維素降解菌株。根據分子鑒定，該菌株屬于Olivibacter屬，為該屬內首次報道的具有纖維素降解能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

園林堆肥樣品：香樟（Cinnamomum camphora）落葉、法國梧桐（Platanus orientalis L.）落葉和杏鮑菇（Pleurotus eryngii）培養物等堆肥。

CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）培養基：氯化鈉6.0 g/L，硫酸銨2.0 g/L，無水氯化鈣0.1 g/L，七水合硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，CMC-Na 10.0 g/L。

纖維素酶底物：10.0 g/L羧甲基纖維素鈉溶于pH 5.0檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化及纖維素降解能力檢測 從堆肥中取樣，按10倍梯度稀釋涂布于CMC-Na平板，每個稀釋度進行3個平行。37℃恒溫培養3 d后挑取單菌落。于CMC-Na平板上進行平板劃線純化。連續5代培養純化后，挑取單菌落接種于CMCNa液態培養基中，37℃培養3 d，取培養上清滴在CMC-Na平板上，37℃恒溫培養5 d后用剛果紅染色液初步檢測纖維素酶活。同時，取0.5 cm × 2 cm的濾紙條滅菌烘干后加入CMC-Na液態培養基中，接入菌液，置于37℃培養10 d后，根據濾紙降解程度初步確定菌株的降解能力。經過上述兩次初步篩選，選取降解性能優良的菌株進行下一步分析。

1.2.2 菌株的16S rRNA基因序列比對分析 挑取單菌落利用PCR［7]擴增16S rRNA基因序列，將PCR產物送交天一輝遠公司測序后獲得16S rRNA基因序列信息，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）上分別進行比對，確定菌株所屬種屬。根據NCBI的16S rRNA基因序列比對結果，下載相近序列后，利用MEGA-X用非加權組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means, UPGMA）構建進化樹［8-9]。利用PAUP* 4.0a169［10]構建最大簡約樹（maximum parsimony tree, MP-tree）。

1.2.3 菌株基因組比較分析 將分離的菌株送生工生物公司進行全基因組測序。相近種屬的基因組序列在NCBI上獲得。利用EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）計算OrthoANIu，在JSpeciesWS（https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/）上計算ANIb和ANIm；利用Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0（https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php）計算DDH；利用Mauve進行共線性比對［11]；用BRIG進行GC值比對，并利用BRIG的基因位置標注功能特別標注纖維素酶相關基因［12]。

1.2.4 生理生化特征檢測 檢測菌株18B和O.jilunii 14-2AT的生長溫度、生長pH、NaCl耐受、糖酵解、硝酸鹽還原、氧化酶和β-半乳糖苷酶活性等生理生化指標。VP測試采用Barritt法。將菌株平板劃線法接種于MacConkey平板，37℃培養3 d連續觀察菌落形態和顏色［13]。

1.2.5 纖維素酶活的測定 酶活單位：1 min催化底物羧甲基纖維素鈉生成1 μmol還原糖的酶量即為1 U。葡萄糖標準曲線的制作參照Miller的方法［14]，使用Cytation3酶標儀測定540 nm吸光度。將菌株按照0.5%（V/V）的比例接種于CMC液體培養基中，37℃，200 r/min培養，不同時間取培養液經0.22 μm濾膜過濾得到粗酶液。將粗酶液100 μL與底物900 μL混合后，對照組立即沸水浴5 min，然后冰浴；實驗組在50℃水浴鍋中反應20 min。隨后向對照組和實驗組中同時添加2.0 mL DNS，沸水浴5 min后，冷卻至室溫，吸取反應液200 μL，加入96孔酶標板中，使用Cytation3酶標儀測定540 nm吸光度。將所得吸光度代入公式：

（k：葡萄糖標準曲線斜率；t：反應時間）計算酶活。

1.2.6 纖維素酶相關基因異源表達及檢測 根據全基因組測序的基因注釋，結合蛋白結構分析，定位菌株纖維素酶相關基因，并對其中酶活潛力最大的蛋白基因克隆進pET26b質粒，將質粒轉入Escherichia coli BL21中。利用IPTG進行誘導表達。檢測異源表達蛋白纖維素降解活性。

2 結果

2.1 菌株的篩選及16S rRNA 序列進化分析

在CMC-Na平板上共純化得到纖維素降解細菌17株，根據濾紙降解能力（圖1-A）和剛果紅褪色圈直徑（圖1-B）確定編號為18B的菌株降解能力最為突出。

圖1 菌株18B纖維素降解能力檢測Fig. 1 Detection of cellulose degradation ability of strain 18B

通過PCR擴增獲得菌株18B的16S rRNA基因序列（1387 bp）及NCBI和EZBioCloud比對發現，與其相似度在97.00%以上的細菌有2株。菌株18B的16S rRNA基因序列在NCBI數據庫中比對結果最相近的分別為O. jilunii 14-2AT（99.35%）和Olivibacter oleidegradans TBF2/20.2T（99.28%）。在EZBiocloud數據庫中比對結果最相近的為O.oleidegradans TBF2/20.2T（99.42%）和O. jilunii 14-2AT（99.13%）。利用MEGA-X構建進化樹，其中UPGMA進化樹見圖2，與菌株18B親緣關系最接近的是O. jilunii 14-2AT和O. oleidegradans TBF2/20.2T兩菌株。利用PAUP構建的MP進化樹（圖3），一致性指數（consistency index, CI）值為0.553，保留指數（retention index, RI）值為0.689，重縮放一致性指數（rescaled consistency index, RC）值為0.381，非同源相似性指數（homoplasy index, HI）值為0.447。MP進化樹與UPGMA進化樹相似，表明結果可信，提示菌株18B屬于Olivibacter屬。

圖2 基于16S rRNA序列構建的非加權組平均法進化樹（以Albibacterium bauzanense BZ42為外群）Fig. 2 UPGMA-tree based on 16S rRNA (Albibacterium bauzanense BZ42 used as the outgroup)

圖3 基于16S rRNA序列構建最大簡約樹（以Albibacterium bauzanense BZ42為外群）Fig. 3 MP-tree based on 16S rRNA (Albibacterium bauzanense BZ42 used as the outgroup)

2.2 菌株18B的基因組比較分析

為進一步鑒定菌株18B，對其進行全基因組測序及比對分析。全基因組測序的結果表明菌株18B的基因組長度為5976 778 bp，利用 EZBiocloud和JSpeciesWS的ANI（average nucleotide identity）計算結果顯示18B和O. jilunii 14-2AT的相似度均在95%以上，不符合新種界定的范圍。EZBiocloud上計算OrthoANIu（orthologous average nucleotide identity），結果顯示18B與O. jilunii 14-2AT的ANI為98.42%。在JSpeciesWS上，以O. jilunii 14-2AT的基因組作為參考序列，ANIb為97.58%，ANIm為98.85%。在Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0計算菌株18B和O. jilunii 14-2AT的DDH（DNA-DNA hybridization），參考結果為87.60%。根據以上結果，可確定18B屬于O. jilunii。對18B和O. jilunii 14-2AT進行進一步的比對分析。圖4展示的共線性結果可知，18B與O. jilunii 14-2AT之間存在著一定的進化關系。圖5展示的為BRIG繪制Olivibacter屬內的基因組比對結果，參考序列為18B，由圖可知18B與該屬內的其他菌株之間存在著一定的進化距離，部分小片段上相似度較低。

圖4 菌株18B和O. jilunii 14-2AT的全基因組共線性比對Fig. 4 Genome-wide covariance alignment of strain 18B and O. jilunii 14-2AT

圖5 Olivibacter屬內基因組比對Fig. 5 Genome alignment within the genus Olivibacter

2.3 生理生化檢測分析

對菌株18B和O. jilunii 14-2AT進行常見生理生化特征比較實驗，發現菌株18B與O. jilunii 14-2AT在生長溫度、氧化酶和糖酵解等方面存在差異（表1）。

表1 18B和O. jilunii 14-2AT常見生理生化特征比對Table 1 Comparison of common physiological and biochemical characteristics between 18B and O. jilunii 14-2AT

2.4 菌株18B產纖維素酶活分析

在LB中轉接一代后，菌株18B產纖維素酶活有明顯的下降，表明菌株18B在營養豐富培養基中培養存在嚴重的產酶退化現象，但是在僅含羧甲基纖維素鈉的培養環境中，菌株18B的退化不明顯（圖6）。同時，未測得O. jilunii 14-2AT的纖維素酶活。

圖6 18B纖維素酶活隨培養時間變化Fig. 6 Variation of 18B cellulase activity with incubation time

2.5 菌株18B纖維素酶合成相關基因分析

因為該屬內的菌株未有關于纖維素降解能力的報道。根據全基因組測序的注釋結果，對菌株18B纖維素酶合成相關基因進行分析，共得到纖維素酶合成相關基因7個（圖4），選擇其中標記為纖維素內切酶的基因序列，使用NCBI蛋白比對功能確定相關基因具有纖維素酶活性位點。最后確定4個最優潛力的纖維素酶合成相關基因。這4個基因分別編碼蛋白為內切葡聚糖酶D前體（endoglucanase D precursor, celD），標記為D；內切葡聚糖酶Z前體（endoglucanase Z precursor, celZ），標記為Z；纖維素酶M（cellulase M），標記為M；純內切葡聚糖酶（putative endoglucanase），標記為P。圖7顯示異源表達后菌液中的基因檢測結果，表明誘導表達后的菌液中攜帶有目的基因。圖8展示的是蛋白質的檢測，表明各基因在該條件下誘導表達成功。D蛋白和P蛋白主要存在于上清中，Z蛋白和M蛋白沉淀中含量更高。同時測得酶活，D蛋白酶活為3.17 U/L，Z蛋白酶活為2.37 U/L，M蛋白酶活為2.57 U/L，P蛋白酶活為1.98 U/L。

圖7 誘導表達后基因檢測Fig. 7 Gene amplification after induction of expression

圖8 纖維素酶基因誘導表達蛋白檢測Fig. 8 Protein assay of cellulase gene induced expression

3 討論

3.1 菌株18B屬于O. jilunii

根據16S rRNA基因序列、全基因組序列和生理生化特征比對，確定菌株18B屬于O. jilunii。其中，菌株18B與O. jilunii 14-2AT的基因組長度差距較大。同時，通過共線性分析可知，菌株18B與O. jilunii 14-2AT存在大區段的重排和缺失。在生理生化特征上，菌株18B和O. jilunii 14-2AT的主要區別在于生長溫度、氧化酶、糖酵解以及纖維素降解。由于堆肥發酵存在高溫時期［15]，菌株18B的生長溫度和最適溫度較O. jilunii 14-2AT有向高溫區段偏移的趨勢。這是一種環境適應性的表現。綜合以上證據，可以判斷菌株18B與O. jilunii的模式菌株存在一定差別，可定為新的生理株，補充了國內該屬的種質資源。

3.2 菌株18B的纖維素降解能力

菌株18B的主要纖維素酶系為內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，根據幾個相關基因的異源表達結果，可知這些基因具有一定的活性。但是相比于全菌的纖維素酶活性，相關基因的纖維素酶活性較低。可能是由以下兩個原因導致。其一，異源表達載體采用T7啟動子，非強啟動子，蛋白表達量有限。其二，菌株18B具有調節纖維素酶基因和運送相關蛋白酶的通路，可增強相關基因的表達并將蛋白酶高效運輸出細胞，以提高培養環境中羧甲基纖維素的利用效率。在內切葡聚糖酶D前體的上游，有外膜蛋白組裝因子BAMB前體（outer membrane protein assembly factor BamB precursor），后者具有組裝和運輸外膜蛋白的功能［16]。同時，通過全基因組測序篩選出菌株18B具有半纖維素酶系相關基因16個，而半纖維素酶可協同促進纖維素酶發揮作用［17]。

3.3 菌株18B的應用前景良好

作為Olivibacter屬內首次報道具有纖維素酶活性的菌株，菌株18B的應用前景也較為廣泛。細菌所產的纖維素大多附著于細胞外膜［18-19]，而菌株18B的纖維素酶活在去除細菌的培養上清中亦可檢測到，表明菌株18B可產生胞外纖維素酶，這一點有利于后續工業化的利用。在羧甲基纖維素鈉培養基中，培養到后期（＞14 d），可通過酸性重鉻酸鉀檢測到培養上清中含有酒精，且16S rRNA測序無雙峰，表明該培養環境無污染。暗示菌株18B在纖維素發酵產乙醇的工業方面亦可有應用。在pH 5.0和pH 7.0的反應條件下，均可檢測到菌株18B培養上清的纖維素酶活，表明該菌株所產纖維素酶系的應用環境廣，在中性和偏酸性環境下均可發揮降解能力。細菌纖維素酶廣泛應用于洗滌劑領域，以提高洗滌劑的去污能力并保持織物表面光滑度［20]。以往研究關于適用于洗滌產品的纖維素酶更多集中于堿性環境，近年來，一些酸性洗滌劑的推廣給耐酸性細菌纖維素酶提供了更多的應用方向。而菌株18B的適應性和酶活力表明在該方向上它有優良的應用前景。

4 結論

菌株18B屬于O. jilunii，是不同于模式菌株的一株生理株，主要區別在于生長溫度和纖維素酶活性。菌株18B具有能合成纖維素酶的基因，主要為內切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。