應用CRISPR/Cas9技術建立ERK激酶相分離熒光探針定點整合的穩定細胞株

楊玉梅 張坤曉

（1. 江蘇海洋大學藥學院，連云港 222005；2. 江蘇海洋大學江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，連云港 222005）

基于液-液相變原理（liquid-liquid phase separation）開發的激酶熒光探針（separation of phasebased activity reporter of kinase, SPARK）是近年來繼分離熒光蛋白技術（split fluorescent protein, split FP）、循環排列的熒光蛋白技術（circularly permuted fluorescent protein, cpFP）以及熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer, FRET）之后的第4種研究蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）的熒光探針技術［1-11]。該技術的原理是利用一對同型寡聚體小肽（四聚體小肽命名為HOTag6，六聚體小肽命名為HOTag3）的多價結合和迅速擴增，將瞬時的PPI轉變成穩定的綠色熒光的形態變化，表現為均勻分布的GFP綠色熒光聚集成高亮度的綠色液珠［12-15]。以檢測ERK激酶活性的ERK-SPARK探針為例，具體做法是將來源于細胞周期蛋白Cdc25C的一段可被ERK識別并被ERK磷酸化的肽段序列（未被磷酸化的肽段記為Perk，磷酸化后的肽段記為Perk-Phospho）與HOTag3（6聚體）融合，而將可識別、結合磷酸化的該肽段的WW結構域與HOTag6（4聚體）融合，并在中間插入熒光蛋白EGFP來獲取熒光信號［16]。當用EGF處理表達ERK-SPARK探針的細胞時，Perk被ERK磷酸化為Perk-Phospho，之后WW結構域識別并結合到Perk-Phospho上。由于六聚體和四聚體的不對稱性，6×Perk-Phospho和4×WW結合后會空余出2×Perk-Phospho，這個2×Perk-Phospho又會結合4×WW，此時會空余出2×WW，如此循環往復，兩組分越聚越多，在極短的時間內即可形成明顯的綠色液滴，聚集的熒光信號是單分子GFP亮度的30-50倍，具有很高的辨識度（圖1）。這類探針可以極高的分辨率和靈敏度在活細胞內實時觀測激酶活性的動態變化，因此理論上有較大的應用前景，特別是在蛋白激酶抑制劑高通量篩選平臺的建立上。

但在實踐中發現，SPARK探針僅能以瞬時表達的方式在細胞內發揮功能，當采用病毒載體將編碼SPARK探針的序列整合至宿主染色體上時，細胞內一種尚不明確的機制會導致SPARK探針的功能完全喪失，因而限制了該技術的應用。且SPARK探針功能的發揮蛋白表達量有密切關系，瞬時表達的不穩定性影響實驗結果的準確性。CRISPR/Cas9 技術是利用Cas9 核酸酶與sgRNA組成的復合體對特異性靶點識別，在基因組上的特定位置對DNA進行雙鏈剪切。發生雙鏈基因組斷裂的DNA可以通過真核細胞自然存在的非同源末端結合（NHEJ）或同源重組（HR）修復，其中同源重組修復機制可將外源片段整合到基因組指定位點，因此CRISPR/Cas9基因組編輯技術可以在基因組層面實現定點基因敲入的操作，且該技術具有效率高、研發周期短等特點。

為了克服使用病毒載體對SPARK探針的潛在影響，本研究利用CRISPR/Cas9介導的同源重組技術［17-19]，在不使用任何病毒相關載體的條件下，將ERK-SPARK熒光探針基因表達盒定點插入人AAVS1位點（位于人PPP1R12C基因第一個內含子內，外源基因插入此位點可長期正常轉錄且不影響細胞其他基因）［20]，成功構建了可被多西環素（doxycycline）誘導表達ERK-SPARK熒光探針的穩定KYSE-150細胞株。該穩定細胞株解決了SPARK熒光探針瞬時表達方式表達量不可控問題，將SPARK探針的序列定點整合至宿主染色體上，可使其長期正常轉錄且不影響細胞其他基因。為后續將SPARK技術應用于高通量篩選蛋白激酶抑制劑奠定了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細胞株（KYSE-150）購于上海北諾生物科技有限公司。pX330、pUC19、pCW-Cas9、pcDNA3.1-ERK-SPARK質粒購于Addgene。Bbs I酶、BsmB I酶、T4 DNA連接酶購自 New England Biolabs（NEB）公司。質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司。DNA提取試劑盒、In-Fusion無縫克隆試劑盒購自TaKaRa公司。Lipofectamine 2000試劑、高糖DMEM培養基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco公司。兔抗GFP的單抗購自美國CST公司。辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。多四環素購自陶素化學。寡核苷酸序列由北京擎科公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA寡核苷酸鏈合成 使用CRISPR在線設計工具（https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）根據評分系統，設計了3個20 bp的sgRNA（sp1、sp2 和 sp3）。分別在編碼鏈模板 5' 端添加 CACCG，非編碼鏈模板 5' 端添加AAAC，3' 端添加C。由北京擎科公司合成。設計的寡核苷酸序列見表1。

表1 構建 sgRNA 表達載體引物、基因組擴增引物信息Table 1 PC construction of sgRNA expression vector primers and genome amplification primer information

1.2.2 CRISPR/Cas9 打靶載體構建 用 T4 DNA 連接酶將Oligo退火形成的雙鏈二聚體與 Bbs I酶切的pX330 骨架質粒連接，轉化DH5α 感受態細胞，均勻涂布于 Ampicillin 抗性的 LB瓊脂培養板上。挑取單菌落進行測序鑒定，擴增鑒定連接成功的菌液，并用質粒抽提試劑盒提取。

1.2.3 AAVS1位點同源重組供體質粒的設計與構建 供體質粒設計的示意圖如下（圖2）。供體質粒兩端750 bp的同源臂通過150基因組PCR獲得；Tet-On 3G表達系統、嘌呤霉素抗性基因序列克隆自pCW-Cas9質粒；ERK-SPARK基因序列及突變體陰性對照克隆自pcDNA3.1-ERK-SPARK質粒。所獲得的片段使用In-Fusion無縫克隆按圖2中的順序連接。

圖2 ERK-SPARK knock-in質粒設計示意圖Fig. 2 Design schematic diagram of ERK-SPARK knock-in plasmid

1.2.4 細胞轉染 將150細胞接種于6孔板中，待其密度接近90%時，每孔分別轉入1 μg CRISPR/Cas9 打靶載體與1 μg的供體質粒。轉染48 h后，將細胞分別轉入10 cm的皿中繼續培養兩周，之后加入2 μg/mL的嘌呤霉素，篩選出對嘌呤霉素具有抗性的細胞亞群。

1.2.5 流式細胞分選 在獲得對嘌呤霉素具有抗性的細胞亞群后，提前24 h加入2 μg/mL的dox，之后將細胞消化進行流式細胞分選，收集GFP陽性細胞。

1.2.6 ERK-SPARK蛋白水平鑒定 將獲得的同時對嘌呤霉素具有抗性、且GFP表達陽性的細胞提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳并轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后GFP一抗4℃孵育過夜，1×TBST 清洗后，二抗溶液室溫孵育1 h，1×TBST再次清洗后，用化學發光儀檢測ERK-SPARK熒光探針蛋白表達情況。

1.2.7 ERK-SPARK熒光探針成像實驗 將獲得的重組細胞鋪接種在96孔板中。加入終濃度為100 ng/mL終濃度的EGF，孵育10 min后置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 同源重組所構質粒的檢測結果

本研究中所構建的質粒經北京擎科公司測序檢測后，序列與設計圖譜完全一致。

2.2 構建AAVS1位點敲入的ERK-SPARK穩定細胞株

若ERK-SPARK基因表達盒成功插入AAVS1位點后，重組細胞將獲得以下性狀：（1）對嘌呤霉素的抗性，這是因為嘌呤霉素基因自身不帶啟動子，由PPP1R12C基因的啟動子啟動表達，因此只有正確插入AAVS1位點的細胞才會獲得對嘌呤霉素的抗性；（2）在加入dox后可檢測到GFP熒光信號。這種設計的優勢在于避免了單克隆細胞株的篩選，大大縮短了穩定細胞系的構建。用嘌呤霉素和流式細胞雙重篩選的策略，排除了部分沒有發生基因重組、但被周圍具有嘌呤霉素抗性細胞所保護的假陽性細胞。對所獲得的重組細胞提取基因組DNA、并進行PCR鑒定后發現擴增得到的片段大小約為6200 bp，與插入片段的大小一致（圖3）。Western blot結果（圖4）顯示，在加入dox誘導24 h，可以檢測到ERKSPARK融合蛋白的條帶，大小分別為51 kD與42.4 kD，與實際大小相符。熒光成像實驗（圖5）顯示，加入dox WT誘導24 h，之后加入EGF激活ERK信號通路后，可觀察到ERK-SPARK的相變信號，而突變體對照組則無信號，這表明本研究所采用的構建SPARK穩定細胞系的方法不影響SPARK的功能。

圖3 基因組PCR檢測KYSE-150細胞株AAVS1位點ERK-SPARK表達Fig. 3 Genomic PCR detection of the ERK-SPARK expression at the AAVS1 locus in KYSE-150 cells

圖4 Western blot 驗證ERK-SPARK在 KYSE-150細胞株中誘導表達Fig. 4 Validating the doxycycline-induced expression of the ERK-SPARK reporter in KYSE-150 cells by Western blot

圖5 EGF處理后 ERK-SPARK knock-in細胞系熒光成像（20X）Fig. 5 Fluorescence images of ERK-SPARK knock-in cells stimulated with EGF（20X）

3 討論

3.1 SPARK探針具有反應靈敏迅速等優點，應用前景廣闊

PPI介導了細胞信號轉導通路，其紊亂與心血管疾病、癌癥等重大疾病的發生發展密切相關，因此開發檢測PPI的熒光探針一直是生物技術領域重要的前沿方向之一。通過設計特定的熒光探針檢測蛋白激酶與其底物的相互作用、從而研究細胞內的“磷酸化事件”又是這類熒光探針設計開發的熱點。在SPARK技術出現之前，熒光能量共振轉移技術（FRET）是較為常用的研究蛋白磷酸化修飾的工具。但FRET技術的信號強度弱、信噪比不高的缺點限制了其在活體成像及高通量篩選上的應用?；谙喾蛛x原理開發的SPARK技術可以實時地捕獲特定靶點瞬間的磷酸化事件，并通過將單分子熒光蛋白快速聚集成直徑為1-2 μm大小的液滴的方式，將磷酸化信號轉換為熒光信號，從而以直觀的方式對激酶活性進行可視化的檢測和定量，是一種全新的、可實時監測激酶活性的工具。

3.2 SPARK瞬時表達的使用方式具有弊端

盡管SPARK技術較FRET技術有諸多的優點，但SPARK技術同樣存在一些明顯的缺陷。首先，由于SPARK技術的設計原理是基于液-液相分離，因此SPARK探針需要在細胞內維持較高的表達水平才能發揮其功能，所以在構建SPARK探針的質粒時需采用強啟動子啟動SPARK的基因表達盒、且需要有較高的細胞內拷貝數。其次，在實踐中發現，采用任何形式的病毒載體將SPARK探針整合到宿主細胞基因組上時都將導致SPARK探針的失效，無法像FRET技術那樣通過慢病毒感染的方式構建表達SPARK探針的穩定細胞系，因此只能通過瞬轉的方式將SPARK送入細胞，在具體的應用場景中會導致細胞的不均一性，部分細胞的激酶活性將無法被檢測到，且當應用在激酶抑制劑的高通量篩選時會增加篩選的步驟與復雜性。最后，在設計任一激酶的SPARK探針時，需要慎重選擇、測試、優化可被該激酶磷酸化的特異性肽段序列，以及可識別、結合磷酸化后的肽段的結構域；若二者的親和力過高，則極易導致假陽性的出現，這是導致部分激酶無法設計為SPARK熒光探針的重要原因。

3.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術使SPARK熒光探針的使用更加穩定可靠

本研究構建的AAVS1位點插入的誘導型ERKSPARK穩定細胞系規避了SPARK技術所存在的部分缺陷，通過采用多四環素誘導的Tet-On 3G系統實現了SPARK探針以可控的方式在細胞內的高表達，而不使用病毒載體的方式保證了SPARK探針在細胞內功能的有效性。利用該穩定細胞株對ERK激酶抑制劑進行篩選，可以將小分子藥物的影響可視化，結合可視化高通量篩選儀器，以熒光信號為標準，對細胞質液滴成像情況進行統計，可提高激酶抑制劑的篩選效率。后續，所構建的穩定細胞系將被應用于ERK激酶抑制劑的高通量篩及探索ERK信號通路中關鍵調控機制的相關研究中。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9介導了同源重組技術，將ERK-SPARK熒光探針定點整合到了人AAVS1位點中，成功構建了誘導表達型的SPARK熒光探針的穩定細胞系。解決了SPARK探針無法通過慢病毒等方式構建為穩定細胞系、進而限制該技術應用場景的瓶頸問題。