苦蕎轉錄因子基因FtbHLH3的克隆、亞細胞定位及表達分析

呂秋諭 孫培媛 冉彬 王佳蕊 陳慶富 李洪有

（貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心，貴陽 550001）

苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）是一種起源于我國西南地區的重要藥食同源小雜糧作物，其種子含有較為豐富的生物活性黃酮類化合物（1%-3%），具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多種保健功能［1-2]。類黃酮作為苦蕎中最主要的保健和品質成分，其含量直接影響著苦蕎的品質。因此，發掘苦蕎類黃酮生物合成調控基因，解析其分子調控機制對高黃酮苦蕎新品種培育具有重要意義。

大量研究表明，植物MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）和bHLH轉錄因子在類黃酮生物合成中具有重要調控作用［3-4]。bHLH轉錄因子是植物中第二大轉錄因子家族，其中最早被功能鑒定調控類黃酮生物合成的是玉米（Zea mays）的ZmB和ZmR，它們通過正調控類黃酮生物合成結構基因ZmA1（DRF）和ZmBz1（UFGT）的表達來調控花青素的生物合成［5]。繼玉米ZmB和ZmR被鑒定后，迄今調控類黃酮生物合成的bHLH轉錄因子已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）（TT8、GL3和EGL3）等30余種植物中被鑒定［6-15]。在所有鑒定的bHLH轉錄因子中，除羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel）LcbHLH92可能通過調控LcTT8基因的表達來負調控原花青素和花青素的生物合成外［15]，其余bHLH轉錄因子均通過直接調控類黃酮生物合成后期結構基因（DFR、LAR、ANS、ARN和UFGT）的表達來正調控或負調控原花青素或花青素的合成。此外，幾個鑒定的bHLH轉錄因子，如玉米ZmR［5]和ZmIn1［16]、楊梅（Myrica rubra（Lour.）S. et Zucc）MrbHLH1［17]、蘿卜（Raphanus sativus L.）RsTT8［8]、鈍鱗紫背苔（Plagiochasma）PabHLH1［10]、梨（Pyrus spp.）PpbHLH64［14]等除調控類黃酮生物合成后期結構基因表達外，還直接調控了類黃酮生物合成早期結構基因（CHS、CHI、F3H、F3'H）的表達，暗示植物bHLH轉錄因子可能還參與調控了原花青素和花青素外的其他類黃酮的生物合成。值得注意的，除羊草的LcbHLH92［15]和梨PpbHLH64［14]外，所有已鑒定的bHLH轉錄因子均屬于植物bHLH轉錄因子家族的IIIf亞家族，它們通常需要與MYB類轉錄因子互作后才具有調控類黃酮生物合成的功能［1,18]。因此，發掘植物中調控類黃酮生物合成的非IIIf亞家族bHLH轉錄因子，對拓展人們對bHLH轉錄因子調控植物類黃酮生物合成的分子機制的認識具有重要意義。

目前，在苦蕎類黃酮生物合成調控研究方面，一些MYB轉錄因子已被鑒定調控了苦蕎類黃酮的生物合成。其中，FtMYB1、FtMYB2、FtMYB15通過正調控DFR、ANS和負調控FLS基因的表達來正調控原花青素和花青素的生物合成［19-20]，而FtMYB3、FtMYB8和FtMYB18則通過抑制原花青素和花青素合成結構基因的表達來負調控原花青素和花青素的生物合成［21-23]。相比較，FtMYB116、FtMYB31、FtMYB6、FtMYBF通過直接激活黃酮醇生物合成基因F3'H、F3H、FLS和UFGT的表達來正調控黃酮醇蘆丁、槲皮素、山奈酚、楊梅素等的生物合成［24-28]，而FtMYB11、FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15 和FtMYB16則負調控黃酮醇蘆丁的生物合成［29-31]。雖然苦蕎中已有10余個MYB轉錄因子被功能鑒定調控了苦蕎類黃酮生物合成，但迄今未見其他類型轉錄因子尤其是bHLH類轉錄因子參與調控類黃酮生物合成相關報道。因此，開展苦蕎類黃酮生物合成相關的特別是不屬于植物中已報道的全新bHLH轉錄因子的鑒定，對全面解析苦蕎類黃酮生物合成的分子調控機制具有重要意義。

在前期的研究中，通過轉錄組和代謝組關聯分析，從苦蕎中鑒定到一個非IIIf亞家族bHLH轉錄因子基因FtbHLH3（FtPinG0000754600.01），可能參與調控苦蕎類黃酮的生物合成［32]。本研究在此基礎上，從苦蕎中克隆了該基因，并對其進行了生物信息學、轉錄特性、亞細胞定位、基因共表達、基因表達量與總黃酮含量間相關性分析，旨在為進一步研究其生物學功能及其分子調控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料為苦蕎品種‘黑苦013號’和本氏煙草［Nicotiana benthamiana（K.）] 。質粒pMD19-T購自TaKaRa公司，pGBKT和16318-hGFP質粒由本實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101和酵母菌株AH109由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA（complementary DNA）合成 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取‘黑苦013’成年植株不同組織部位（莖、頂端1葉、頂端3葉、花，授粉后7、13、16 d的種子）的總RNA。用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa，大連），以頂端3葉總RNA為模板，反轉錄合成用于基因克隆的第一鏈cDNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，大連），以各組織部位的總RNA為模板，反轉錄合成用于熒光定量的第一鏈cDNA。

1.2.2 FtbHLH3全長CDS序列克隆 根據苦蕎基因組中FtbHLH3的參照CDS序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計擴增目標基因的特異引物FtbHLH3F1和FtbHLH3R1（表1）。利用KOD高保真酶，以葉cDNA為模板進行PCR擴增，擴增完成后用Tap酶進行加A反應。利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收目的片段并連接pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌感受態DH5α。轉化子經PCR檢測后，送陽性克隆至生工生物工程（成都）股份有限公司測序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.3 FtbHLH3的生物信息學分析 用在線軟件ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder）查詢FtbHLH3的開放閱讀框（open reading frame,ORF）；用BioXM 2.6軟件預測其編碼蛋白的等電點和分子量大小；用ProtScale 軟件分析其親/疏水性；通過NCBI數據庫進行FtbHLH3同源比對和保守結構域查詢；用MEGA 7.0.21軟件，通過最大似然法（ML）構建FtbHLH3蛋白的系統進化樹。

1.2.4 FtbHLH3的亞細胞定位 設計分別帶Sal I和BamH I酶切位點的FtbHLH3的上下游特異引物FtbHLH3F2和FtbHLH3R2（表1），以測序正確的pMD19-T-FtbHLH3質粒為模板進行PCR擴增。然后，用Sal I和BamH I對PCR產物和16318-GFP空載體進行雙酶切，純化回收酶切產物并用T4 DNA連接酶連接，構建35S∷FtbHLH3-GFP亞細胞定位載體。亞細胞定位具體操作參照孫小倩等［28]的方法進行。

1.2.5 FtbHLH3的轉錄激活活性分析 設計分別帶EcoR I和BamH I酶切位點的FtbHLH3的上下游特異引物FtbHLH3F3和FtbHLH3R3（表1），以測序正確的pMD19-T-FtbHLH3質粒為模板進行PCR擴增。隨后，通過雙酶切法將FtbHLH3連接到pGBKT7載體上，構建酵母表達載體pGBKT7-FtbHLH3。將pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7（陰性對照）和pGBKT7-53（陽性對照）質粒利用LiAc法分別轉化酵母菌株AH109，并在SD/-Leu-Trp、SD/-Ade-His-Leu-Trp和含有 X-α-gal的SD/-Ade-His-Leu-Trp培養基上培養 5 d，觀察并拍照。

1.2.6 FtbHLH3與苦蕎類黃酮生物合成結構基因的共表達分析 利用Li等［32]和Zhang等［33]發表的轉錄組數據，獲得FtbHLH3和另外36個在種子差異表達的bHLH轉錄因子基因及14個苦蕎類黃酮生物合成結構基因（3個CHS、1個CHI、2個F3H、2個F3'H、1個F3'5'H、1個FLS、1個ANS、1個ANR、1個DFR和1個LAR）在苦蕎不同組織（根、莖、葉、花和3個發育時期種子）的FPKM表達值，用TBtools進行基因表達聚類分析，確定FtbHLH3與苦蕎類黃酮生物合成結構基因的共表達關系［28,32-33]。

1.2.7 FtbHLH3在苦蕎不同組織部位中的表達分析及總黃酮提取 設計FtbHLH3的實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）引物FtbHLH3qF和FtbHLH3qR。利用SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒，以苦蕎‘黑苦013’成年植株的莖頂端1葉、頂端3葉、花、授粉后7、13和16 d的種子cDNA為模板，FtActin7為內參基因進行熒光定量分析，檢測FtbHLH3在苦蕎不同組織部位的表達情況。各樣品的總黃酮的提取及測定參照呂丹等［34]的方法進行。

1.2.8 FtbHLH3在苦蕎不同組織部位中的表達量與總黃酮含量間的相關性分析 利用Excel中的單因素方差分析法分析FtbHLH3表達量在不同組織間的差異顯著性和總黃酮含量在不同組織部位間的差異顯著性，當P ＜ 0.05時認為有顯著性。利用EXCEL2013和AI軟件進行作圖。

2 結果

2.1 FtbHLH3的克隆及其編碼蛋白的特征分析

利用基因特異引物FtbHLH3F1和FtbHLH3R1，以苦蕎成年植株頂端3葉cDNA為模板，通過RTPCR擴增到一條約750 bp的條帶，與預期條帶大小相似（圖1）。測序結果顯示，該條帶與參照序列完全一致，大小為783 bp，編碼260個氨基酸。BioXM 2.6和ProtScale分析表明，FtbHLH3蛋白理論分子量為29.34 kD，等電點為6.07，為疏水性蛋白。通過NCBI中的Conserved Domain數據庫分析FtbHLH3和擬南芥中已知的類黃酮生物合成相關的bHLH轉錄因子TT8、GL3、EGL3、MYC2和它們在苦蕎中的同源蛋白的保守結構域，結果表明FtbHLH3蛋白含有bHLH轉錄因子的保守結構域，而其他蛋白除含有bHLH轉錄因子的保守結構域外，還含一個與MYB轉錄因子互作的保守結構域。

圖1 FtbHLH3的克隆Fig. 1 Cloning of FtbHLH3

2.2 FtbHLH3的系統進化分析

根據文獻和NCBI數據庫，獲得植物中已知功能的調控類黃酮生物合成的bHLH轉錄因子的蛋白序列，同時通過擬南芥tair數據庫獲得FtbHLH3在擬南芥中的同源蛋白AtbHLH3a和AtbHLH3b的蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件以最大似然法構建系統進化樹。結果如圖2所示，在所有已知的調控類黃酮生物合成的bHLH轉錄因子中，除羊草LcbHLH92 與bHLH轉錄因子家族IVd亞家族成員聚為一支，其他蛋白均聚在IIIf亞家族分支上。相比較，FtbHLH3與其擬南芥同源蛋白AtbHLH3a和AtbHLH3b單獨聚為一支。

圖2 FtbHLH3與已知的調控類黃酮生物合成的bHLH蛋白的系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of FtbHLH3 and known bHLH protein regulating flavonoid biosynthesis

2.3 FtbHLH3的蛋白亞細胞定位分析

將構建好的35S∷FtbHLH3-GFP載體和16318-GFP空載體（對照）通過農桿菌介導法注射侵染本氏煙草葉片，進行瞬時表達，在共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號。結果如圖3所示，空載體的熒光信號分布在細胞膜、細胞質和細胞核上，而35S∷FtbHLH3-GFP的熒光信號只分布在細胞核上，表明FtbHLH3定位于細胞核。

圖3 FtbHLH3亞細胞定位Fig. 3 Subcellular localization of FtbHLH3

2.4 FtbHLH3的轉錄激活活性分析

通過LiAc轉化法將pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7（陰性對照）和pGBKT7-53（陽性對照）質粒分別轉化酵母菌株AH109中檢測FtbHLH3的轉錄激活活性。結果（圖4）顯示，pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7和pGBKT7-53在SD/-Leu/-Trp二缺培養基上均能生長，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培養基上只有陽性對照pGBKT7-53能生長，且其在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal培養基上顯藍色，表明FtbHLH3不具有轉錄激活活性。

圖4 FtbHLH3在酵母中轉錄自激活活性鑒定Fig. 4 Identification of transcriptional self-activation activity of FtbHLH3 in yeast

2.5 FtbHLH3與苦蕎類黃酮生物合成結構基因的共表達分析

利用公共可用的轉錄組數據，對FtbHLH3和另外36個在種子中差異表達的bHLH轉錄因子基因及14個類黃酮生物合成結構基因進行共表達分析。結果（圖5）顯示，FtbHLH3與3個bHLH轉錄因子基因（包含擬南芥類黃酮生物合成關鍵調控轉錄因子基因TT8的同源基因FtTT8）、12個類黃酮生物合成結構基因（3個CHS、1個CHI、2個F3H、2個F3'H、1個ANS、1個ANR、1個DFR和1個LAR）共表達，它們均在根、莖、葉和授粉后13 d的種子中高表達。表達相關性分析顯示，FtbHLH3和FtTT8分別與9個和10個類黃酮生物合成結構基因間存在顯著正相關（r＞0.8，P＜0.05），且其中8個類黃酮生物合成結構基因與FtbHLH3和FtTT8均存在顯著正相關（表2）。

圖5 FtbHLH3與苦蕎種子差異表達bHLH轉錄因子基因和類黃酮生物合成結構基因的表達聚類熱圖Fig. 5 Expression cluster heat map of FtbHLH3, differentially expressed transcription factor bHLH genes and flavonoid biosynthesis structure genes in tartary buckwheat seeds

表2 FtbHLH3與類黃酮生物合成結構基因表達相關系數Table 2 Correlation coefficient between FtbHLH3 and flavonoid biosynthesis structure gene expression

2.6 FtbHLH3在苦蕎不同組織部位中的表達量與總黃酮含量間的相關性分析

利用實時熒光定量 PCR分析FtbHLH3在苦蕎成年植株不同組織部位中的表情況，結果如圖6-A所示，FtbHLH3在葉、授粉后13 d的種子和莖中高表達，與轉錄組數據相符。總黃酮含量分析表明（圖6-B），苦蕎頂端3葉總黃酮含量最高（5.37%），隨后依次為頂端1葉（3.90%）、莖（3.68%）、授粉后13 d種子（3.07%）、授粉后16 d種子（2.56%）、授粉后7 d種子（2.09%）和花（1.33%）。FtbHLH3表達量與總黃酮含量相關性分析顯示（圖6-C），在不同組織部位中FtbHLH3的表達量與總黃酮含量顯著相關（R2=0.81，P=0.01）。

3 討論

苦蕎是一種重要的小雜糧，其含有豐富的黃酮類化合物，具有極高的保健作用。近年來，有關苦蕎黃酮化合物生物合成的分子機制研究已成為苦蕎分子生物學領域的研究熱點。隨著苦蕎基因組的解析，苦蕎黃酮化合物生物合成途徑已基本明晰，大多數黃酮生物合成結構基因已被功能驗證［33,35-37]。此外，多個調控苦蕎黃酮化合物生物合成的調控基因也被鑒定，但它們主要是MYB類轉錄因子［19-31]。大量研究表明，bHLH轉錄因子在植物黃酮化合物生物合成中也具有重要的調控作用［3-4]。然而，目前苦蕎中未見參與調控黃酮化合物生物合成的bHLH轉錄因子報道。本研究在前期研究基礎上，克隆了一個調控苦蕎黃酮化合物生物合成的候選基因FtbHLH3，對其進行了生物信息學、轉錄特性、亞細胞定位、基因共表達、基因表達量與總黃酮含量間相關性等方面的分析和研究。

3.1 FtbHLH3是不具有轉錄激活活性bHLH轉錄因子家族成員

bHLH轉錄因子是植物中第二大轉錄因子家族，其家族所有成員的蛋白序列中均含有一個保守的bHLH結構域［3,7-8]。本研究利用RT-PCR方法從苦蕎品種‘黑苦013’中克隆了前期研究鑒定的調控苦蕎黃酮化合物生物合成的候選bHLH轉錄因子基因FtbHLH3。蛋白序列保守結構域和亞細胞定位分析顯示，FtbHLH3含有bHLH轉錄因子家族的保守結構域［3,7-8]，其蛋白亞細胞定位于細胞核，具有典型的轉錄因子亞細胞定位特性，表明其是一個bHLH轉錄因子家族成員。FtbHLH3的轉錄激活活性分析表明，其不具有轉錄激活活性，暗示其可能通過與其他具有轉錄激活作用的轉錄因子互作來調控下游靶基因表達。

3.2 FtbHLH3可能是植物中調控類黃酮生物合成的全新bHLH轉錄因子

植物bHLH轉錄因子在類黃酮生物合成中具有極其重要的調控作用［3-4]。目前已報道的調控類黃酮生物合成的bHLH轉錄因子主要通過調控類黃酮生物合成結構基因表達來調控類黃酮生物合成，如玉米ZmR［5]和ZmIn1［16]、楊梅MrbHLH1［17]、蘿卜RsTT8［8]、鈍鱗紫背苔PabHLH1［10]和梨PpbHLH64［14]已被功能和生化實驗證實通過直接調控黃酮化合物生物合成結構基因CHS、CHI、F3H、F3'H、ANS、ARN、DFR、LAR和UFGT的表達來調控黃酮化合物的生物合成。在本研究中，利用公共可用的轉錄組數據進行基因共表達分析發現，FtbHLH3與調控擬南芥黃酮化合物生物合成的關鍵bHLH轉錄因子基因TT8的同源基因FtTT8和12個類黃酮生物合成結構基因（3個CHS、1個CHI、2個F3H、2個F3'H、1個ANS、1個ANR、1個DFR和1個LAR）共表達。RT-qPCR分析顯示，FtbHLH3在苦蕎不同組織部位中的表達模式與來自轉錄組數據的表達模式高度相似。此外，FtbHLH3在不同組織部位中的表達量與總黃酮含量間的相關性分析顯示，其表達量與總黃酮含量間存在極高的正相關性。這表明，FtbHLH3是苦蕎中一個重要的黃酮化合物生物合成調控基因，其可能通過正調控黃酮化合物生物合成結構基因的表達來正調控黃酮化合物的生物合成。

在植物中，目前已鑒定的調控黃酮化合物生物合成的bHLH轉錄因子，除羊草LcbHLH92［15]和梨PpbHLH64［14]外，均屬植物bHLH轉錄因子家族的IIIf亞家族成員［18]。本研究中，系統進化分析顯示，FtbHLH3與已知的調控黃酮化合物生物合成的bHLH轉錄因子IIIf亞家族和IVd亞家族成員不聚為一支，暗示其可能是植物中一個調控黃酮化合物生物合成的全新bHLH轉錄因子。在植物中，大多數調控黃酮化合物生物合成的bHLH轉錄因子需要與MYB轉錄因子互作來調控黃酮化合物的生物合成［6-15]。本研究中，FtbHLH3的蛋白結構域分析顯示，其不含有與MYB蛋白互作的結構域。此外，轉錄激活活性分析結果顯示，FtbHLH3不具有轉錄激活活性。這些結果表明，FtbHLH3可能通過與其他類型的轉錄因子互作來調控苦蕎黃酮化合物的生物合成。然而，有關FtbHLH3的功能及調控黃酮化合物生物合成的分子機制有待進一步研究。

4 結論

FtbHLH3是一個非IIIf亞家族bHLH轉錄因子成員，其編碼蛋白定位于細胞核、不具有轉錄激活活性，其可能通過與非MYB轉錄因子互作來調控苦蕎黃酮化合物生物合成結構基因的表達來調控黃酮化合物的生物合成。