先天性巨結腸早期診斷的研究進展

鄭 懿 余家康

廣州市婦女兒童醫療中心新生兒外科 （廣州 510623）

先天性巨結腸又被稱作為赫爾施普龍病（Hirschsprung’s disease，HSCR），是以消化道末端腸神經節細胞缺如為基本病理特征的消化系統先天性畸形，占兒童消化系統出生缺陷疾病譜的第二位，發病率約1∶5 000，是小兒外科臨床工作中的常見病與診療重點［1］。目前認為HSCR主要的病理生理改變是在胚胎發育期間，來源于迷走神經干的腸神經嵴干細胞（enteric neural crest cells，ENCCs）遷移到結腸中形成被稱為肌間神經叢（Auerbach叢）（在腸壁的平滑肌肌層之間）和黏膜下神經叢（Meissner叢）（在腸壁的黏膜下層內）的腸神經網絡，如果這一生理發育過程中ENCCs遷移障礙，則會導致結腸為主的腸神經叢發育缺陷，缺乏成熟的調節腸分泌和蠕動功能的神經節細胞，病變腸段持續痙攣失去收縮功能，導致長期糞便潴留，近端腸管在壓力下代償性肥厚擴張，造成患兒腹脹、便秘、腸炎、營養發育不良等腸梗阻的臨床癥狀［2］。對于新生兒期發病的患兒，多在出生后即出現胎便排出延遲、腹脹進行性加重，嚴重者可發生巨結腸相關性小腸結腸炎，甚至腸穿孔的風險，這也是HSCR患兒新生兒期致死的主要原因。根據HSCR的病理學分類標準，我國學者將其分為：短段型、常見型（普通型）、長段型和全結腸型，以及更為罕見的全腸型和特殊類型［3］，其中以長段型及以上，即累及橫結腸及以上腸段的病理類型，具有更高的術前腸炎反復發作、甚至穿孔的風險。文獻報道，約5%新生兒期起病的患兒因結腸穿孔接受手術造瘺治療，而術前出現巨結腸相關性小腸結腸炎的概率亦高達6%～60%［4-5］。因此早期進行疾病的診斷并及時預防干預，對于降低并發癥的發生和圍術期病死率尤為重要。

1 傳統診斷方法在嬰幼兒患者中應用

目前鋇灌腸是低日齡患兒尤其是新生兒期的主要診斷方法，相較于其它方法，鋇灌腸具有操作簡單，創傷小、結果客觀、易于普及等優點，典型影像特征表現為狹窄與擴張交界的移行段腸管顯影、毛刺樣的黏膜形態、結腸袋結構消失、24小時排泄相鋇劑潴留，但由于新生兒尤其是小于35周齡的早產兒腸神經系統發育尚未完全，腸神經節密度及形態存在日齡差異性，敏感度和特異度分別僅為70%和83%，遠低于6月齡以上的嬰幼兒患者，而在長段型及以上的患兒中，典型的影像學特征與腸神經節缺如的病變范圍差異率甚至高達42%，且對于低日齡患兒，灌腸操作及鋇劑殘留也存在腸梗阻、腸穿孔等風險［6-7］。而肛門直腸測壓創傷相較更小，但技術本身具有一定人員及儀器設備要求，且有研究發現，在小于6個月嬰兒的診斷準確性的亞組分析中，其敏感度和特異度僅為85%～89%，在新生兒患兒中直腸肛門抑制反射更是難以引出，經過與直腸活檢這一金標準進行結果比對發現，兩者差異也很大，因此并不是低日齡患兒的首選檢查方法［8］。當然，隨著技術水平的進步，亦有更精確、更靈敏的傳感器或圖像處理系統面世，也將提高肛門測壓的應用年齡降低及準確率［9］。

活組織檢查創傷較大，但此為疾病診斷的金標準，主要有直腸黏膜抽吸活檢和全層活檢兩種方法，直腸黏膜抽吸活檢操作相對簡便，其特異度可高達95%，但敏感度波動也較大，與患兒日齡密切相關，一項回顧性研究表明，小于39天的患者中，診斷敏感度僅為50%，而較大年齡組中可達88%，這可能與新生兒期腸神經仍處于不斷發育成熟過程有關［10-11］。抽吸活檢往往無法充分暴露齒狀線，取材過程中有可能涉及直腸末端生理性無神經節細胞區，抽吸過程可能得不到足夠多的黏膜下層樣本，是影響診斷特異度的因素。為進一步提高活檢陽性檢出率，可采取全層腸活檢，能夠提供較多的腸管層次及組織量，但麻醉、創傷、出血及吻合口瘺的風險也會相應升高，一般僅針對新生兒期急性腸梗阻需手術治療的病人，直腸上段的全層腸活檢可作為HSCR排除性診斷的有效方法［12］。另外，標本的組織化學染色也是對病理診斷的補充，較為常用的為乙酰膽堿酯酶染色和calretenin化學染色，但二者也存在假陰性的可能性，因此也有越來越多的組化染色輔助診斷指標被發現。膽堿轉運體染色是較為常見的替代方案，有研究發現，異常的膽堿轉運體染色貫穿整個無神經節腸段，并進入移行段，尤其在超短段型患兒的應用中可以減低calretinin的假陰性率［13-14］。另外，亦有其它神經元特異性標記物，包括NCAM、PGP9.5、HuC/D、S-100等也應用于輔助病理診斷，但神經節細胞是否存在及其形態、肥大神經叢的識別仍是病理診斷至關重要的特征［12，15-16］。基于上述，傳統診斷方法在新生兒期HSCR疾病早期診斷中的應用仍存在限制及不足。因此越來越多的研究聚焦于疾病早期、無創、且特異度相對較高的診斷指標的挖掘及探索。

2 新型的可視化影像診斷技術

基于上述傳統常規診斷方法在低齡嬰幼兒尤其是新生兒期應用的限制，如鋇灌腸及直腸肛門測壓的診斷效率較年長兒低，病理活檢穿孔及出血等并發癥的發生率較年長兒高［2］，新型的影像可視化技術也輔助優化新生兒期HSCR的診斷。光譜成像技術優勢在于無創的采樣方法，經過特殊的計算機算法，可以提高正常與無神經節腸管的分辨率，動物研究中已證實，HSCR小鼠模型可達到97%敏感度及94%特異度，陽性診斷率為92%，此項技術有望在日后應用于術中輔助手術醫生明確病變范圍［17］。基于光學斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）技術開發的高分辨光學斷層顯微鏡，脫離了實驗室特殊化學染色的限制，實現可視化深層組織中肌間神經叢的分布，在小日齡HSCR小鼠模型中能夠清晰區分正常與無神經節腸段［18］。激光共聚焦內窺鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）是另一種可視化腸神經叢的技術，具有可應用于活體內觀察的優點，通過神經元特異性結合染料，更直觀顯示結腸黏膜下神經叢，對于活體內神經叢的術中診斷準確率可達88%，但其技術限制在于共聚焦層面而對于結腸結構的分層識別較困難，在不平整的活體腸道中將聚焦平面聚集在診斷層面是主要的技術挑戰［19］。另外，超聲在診斷領域應用廣泛，超高頻超聲在HSCR診斷的研究中發現，HSCR患兒離體病理腸管標本可以進行正常和無神經節段的超高頻超聲成像，對于解剖層次的識別比CLE更為清晰，可應用于不同年齡段患兒腸神經節數量及密度的評估，此項研究為肛門拖出先天性巨結腸根治術中診斷切除范圍奠定了臨床應用基礎［20］。此類影像學檢查手段具有較高的技術要求，且仍需要更多的人體樣本驗證，暫未得到廣泛應用。

3 具有遺傳背景的基因診斷

由于HSCR產前診斷中缺乏典型胎兒篩查特征，且該病為非孟德爾遺傳，表型表達多樣，外顯率不完全，是多個遺傳基因座和表觀遺傳/環境因素之間復雜相互作用的結果，因此單獨的基因診斷，尤其是產前診斷困難，但遺傳學分析可以幫助臨床醫生進行風險分級并識別高危患兒，例如長段型較短段型患者后代中疾病發生的概率明顯增高，患兒兄弟姐妹中疾病風險根據病理類型及性別，最高可達33%［21］。非綜合征HSCR占受影響兒童的70%，約30%受HSCR影響的兒童具有相關的染色體（12%）和/或伴有其它系統的出生缺陷（18%）［22］。與HSCR相關的常見綜合癥包括唐氏綜合征、Waardenburg綜合征、Goldberg綜合征、多發性內分泌腫瘤2A、先天性中央通氣不足綜合征和Mowat-Wilson綜合征等，若圍生期檢測發現上述綜合癥相關基因突變，則提示兒科醫生應評估伴發腸神經系統異常的可能，減低患兒巨結腸危象的發生風險［23-25］。

截至目前，有關HSCR的發病機制尚不明確，目前研究表明常見的非編碼變異、罕見的編碼變異和影響腸神經嵴細胞命運的基因拷貝數變異均在HSCR 基因組研究中被發現，通過外顯子測序、功能基因組測序和單核苷酸多態性基因拷貝數分析，發現可以在約50%具有明顯表型的嬰兒中鑒定出可能對巨結腸病易感的相關變異［26］。有文獻報道，HSCR的遺傳學背景是復雜的，涉及多個易感基因座，酪氨酸蛋白激酶受體（protooncogene tyrosine-protein kinase receptor，RET），位于染色體位點10q11，其相關通路是目前學界認為與HSCR的發生發展最相關的變異，其基因變異檢出率最高（21.7%），其次是EDNRB、NRG1和NTRK1的突變（13%），L1CAM、CYP2B6和GEMIN2的突變（4.3%），它們加劇了與RET基因相關的遺傳易感性，而家族性病例的基因變異檢出率更是高達87.5%，明顯高于散發性病例的40%［27］。綜合癥型HSCR的圍產期遺傳咨詢，特別是對于已有明顯家族聚集性傾向、并在先證者中已檢測到已知有害突變的家系病例，應被視為遺傳診斷管理的一部分［28］。但同時也有研究發現，RET突變相關HSCR患者的基因型和表型無直接關系，對具有家族遺傳背景的產前羊水樣本和臍帶血進行檢測，確認胎兒存在RET突變，但在隨訪中發現未表現出典型的HSCR疾病表型特征，這表明該病是一種具有多種表型表達和不完全外顯的非孟德爾遺傳病［28］。這也符合“基因-環境”相互作用學說的理論，在易感基因突變的遺傳背景條件下，孕期的環境因素，如葉酸的攝入、視黃醇合成的缺乏等因素均可導致神經元及神經膠質細胞亞型轉化異常及神經營養功能的缺失，最終表現為相似遺傳背景下的不同外顯率［29-30］。因此，單一的基因組層面檢測在臨床上對疾病診斷的幫助有應用條件，更多的獲益存在于高危新生兒中的篩查和診斷提示，例如，研究發現父母中有一方為長段型巨結腸，其新生兒有 20% 的患病風險［22］，所以在臨床工作中，對于一些遺傳和家族風險較高的新生兒，即使沒有典型的臨床癥狀，根據具體情況也可能進行直腸病理活檢，進一步避免延誤診斷和治療的風險，但在缺乏進一步研究完整性的情況下，使用產前檢測進行干預可能還為時過早。

4 血漿游離生物標記物的早診指標

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指一類不能翻譯為蛋白質的功能性RNA分子，主要分為短鏈的siRNA、miRNA和piRNA，以及長鏈的lncRNA。研究發現，神經嵴細胞在胚胎發育過程中的增殖、遷移和分化是多個基因共同調控的結果，基因的表達和抑制受到多種因素的影響。但miRNA在進化過程中高度保守，在胚胎早期神經發育過程中具有明顯的時序性，如與神經可塑性相關的miRNA132和miRNA124，與神經退行性病變相關的miRNA221和miRNA101［31-32］，研究亦證實lncRNA可以調節神經發育中的關鍵基因，并通過多種方式影響神經元和膠質細胞的轉分化，包括抑制轉錄、染色質重塑和明顯的修飾［33］。因此在ncRNA領域的研究中，miRNA和lncRNA均有研究證實與HSCR的發病密切相關，近些年也被應用于疾病的無創性早期診斷中。

外周血miRNA在循環中相對穩定，檢測方法相對簡單。它最早被用于腫瘤疾病的早期診斷。研究發現外周血miRNA可以反映早期腫瘤的存在，與腫瘤的晚期侵襲、轉移、復發、化療敏感有關。例如，miR-1246、miR-21和miR-155通過miRNA芯片檢測與食管癌的侵襲和復發相關，可作為一種新的疾病診斷和預后標志物［34］；外周血外泌體中檢測的miRNA包括let-7a，miR-1229，miR-1246，miR-150，miR-21，miR-223、miR-23a和miR-378的表達與結直腸癌的診斷和預后密切相關［35］。因此，在HSCR早期診斷領域的研究，也聚焦于循環miRNA在該疾病早期診斷及預后的應用。有研究發現，在患者和正常對照的血清標本中，miR-133a、miR-218-1、 miR-92a、miR-25 和 miR-483-5P 與疾病的發生正相關，可以作為HSCR新的無創性早期篩查血清標志物［36］。鑒于miRNA的豐富性以及miRNA與靶基因之間的非單一配對關系，在HSCR復雜的遺傳背景下，一些學者篩選了不同miRNAs組合的表達譜芯片，用于疾病的早期診斷或巨結腸相關腸炎的檢測，而血漿外泌體中存在更穩定的內源性miRNAs，通過外泌體的提取和表達譜的鑒定，發現miR-494-3p、miR-668-3p、miR-323a-3p和miR605-3p的高表達與miR-5701的低表達和疾病的發生有關，可用于早期無創診斷［37］。LncRNA在HSCR診斷方面的研究相對較少，這主要是因為早期認為LncRNA為轉錄副產物，生物學效應不明，隨著研究的不斷深入，學者發現LncRNA通過結合轉錄因子、增強子、組蛋白等特定區域也可以發揮轉錄或轉錄后修飾的作用，具有調控功能基因表達的作用，例如lncRNA-MDl通過結合miR-133和miR-135影響MAMLl和MEF2CE基因的表達，參與肌細胞的分化功能［38］。在腸神經早期分化與發育過程中，lncRNA也發揮重要作用，如lncRNA表達譜芯片檢測HSCR擴張與狹窄腸管發現，ENST00000467240.1、ENST00000479039.1、ENST00000485020.1、TCONS00007196和NR034126.1有明顯差異表達；lncRNA-HAll7可能通過DPF3調控神經增殖與分化成熟［39-40］。雖然目前尚沒有LncRNAs用于HSCR早期診斷的臨床效能評估研究，但這仍是疾病輔助診斷的備選之一。

5 不足與展望

HSCR仍然是兒童外科、胃腸病和遺傳學面臨的臨床挑戰，盡管過去十幾年來，疾病的診斷和圍術期管理取得了很多診療進展，但在改善該疾病兒童的長期預后方面仍任重道遠。疾病早期特異性高的診斷方法可以避免消化系統發育不良、嚴重便秘甚至危及生命的小腸結腸炎的發生，對于降低漏診率、改善預后至關重要。隨著病理學、遺傳學和新型影像技術的進步與發展，未來必定可以提高絕大多數病例快速、無創和準確的診斷效率。其次，為更好地體現神經節細胞密度和不同亞型神經元比例的病理特征，對于患者“正常神經節”的定義也需進一步規范。描繪不同年齡層次和不同取材部位的大數據疾病組織圖譜將是推進我們研究的關鍵。最后，手術仍然是基于切除無神經節細胞段為目的，術式的選擇在過去十幾年間并沒有明顯變化，希望隨著早期診斷和無創檢測技術的不斷進步，能夠對疾病進行更早的評估和干預，降低圍術期并發癥，改善患兒預后，并對干細胞治療等多樣化的綜合治療方法進行研究和臨床轉化，這將是未來疾病診療研究的重要方向。