合作豬StAR基因克隆、組織表達及生物信息學分析

閆尊強,計亞楠,王鵬飛,張 博,石海霞,滾雙寶,2

(1.甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省現代養豬工程技術研究中心,甘肅 蘭州 730070)

類固醇激素合成急性調節基因(Steroidogenic acute regulatory,StAR)在睪丸、卵巢、肝臟等組織中表達,編碼的StAR蛋白是類固醇激素急性調節蛋白相關的脂質轉移域家族的重要成員之一,在類固醇激素合成過程中起重要作用[1-3]。StAR蛋白主要由α-螺旋和β-折疊組成,屬于轉運蛋白,前體蛋白有285個氨基酸,逐步加工為成熟蛋白,活性部位為羧基端,稱為StAR相關脂質轉運結構域(StAR-related lipid transfer,START)[4-6]。StAR蛋白是類固醇激素合成過程中重要的限速酶,能結合線粒體外膜中的膽固醇,轉運至內膜(羧基端協助膽固醇從含量多的線粒體外膜轉運至含量低的線粒體內膜上,氨基端引導其定位到線粒體上),進入內膜中的膽固醇被細胞色素P450支鏈裂解酶催化生成孕烯醇酮,孕烯醇酮離開線粒體后在機體不同組織中合成孕酮、睪酮、雌激素、醛固酮等類固醇激素[7-8]。有研究表明,StAR基因突變后膽固醇很難轉化成孕烯醇酮,導致先天性腎上腺增生[9-10];睪丸間質細胞StAR基因表達量降低,引起間質細胞線粒體內膜的膽固醇供應減少,睪酮生成不足,造成不育[11-12];StAR-/-小鼠卵巢中的脂質大量積累,雌激素水平降低,乳房發育不良[13],說明StAR基因在動物生殖活動中有重要功能。

合作豬(又稱山豬、蕨麻豬)適應極端惡劣氣候環境,主要分布于甘肅省甘南藏族自治州的合作、夏河、迭部等縣(市)的高海拔牧區,是我國獨有的小型高原型豬種[14-17]。StAR基因與畜禽繁殖性能密切相關,但未見合作豬StAR基因研究的報道。因此,本試驗通過克隆合作豬StAR基因并進行生物信息學分析,利用實時熒光定量PCR技術檢測不同組織中StAR基因表達量,為深入研究該基因在合作公豬性成熟過程中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

選擇甘肅省甘南藏族自治州農戶放牧飼養的3月齡合作公豬,屠宰后采集睪丸、心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、空腸和回腸組織,液氮速凍,帶回實驗室-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購自北京全式金公司,PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、SYBRTMPremixExTaqTMⅡ熒光定量試劑盒、pMD19-T載體購自TaKaRa公司,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、2×Taq Master Mix、DH5α感受態細胞和質粒提取試劑盒均購自天根公司,其他試劑購自Solarbio公司。

1.3 總RNA提取及反轉錄

用TRIzol提取睪丸、心等組織總RNA,用反轉錄試劑盒合成cDNA,反轉錄體系20 μL:①5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,Total RNA 1 μL(0.5 μg/μL),gDNA Eraser 1 μL,RNase Free H2O 6 μL,42 ℃反應2 min;②上一步驟的10 μL反應液加PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL,RT Prime Mix 1 μL,5 ×PrimeScript Buffer 4 μL,RNase Free H2O 4 μL,37 ℃反應15 min,85 ℃反應5 s。反應結束后,-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計及合成

根據GenBank收錄的豬StAR基因序列(NM_213755.2)及內參GAPDH基因序列(NM_001206359.1),引物使用Primer 5.0軟件設計,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.5 表達量檢測

以cDNA為模板,用RT-qPCR檢測StAR基因在睪丸、心等組織中的表達量。反應體系20 μL,其中SYBRPremix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/μL),cDNA 2 μL,RNase Free H2O 6.4 μL。反應條件為95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,40個循環;72 ℃ 20 s。GAPDH基因為內參,用2-ΔΔCt法[18]計算相對表達量,用平均值±標準差(Mean±s)表示,用SPSS 20.0軟件中單因素方差Duncan程序進行顯著性檢驗。

1.6 克隆及測序

睪丸StAR基因PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳,純化目的片段,與pMD19-T載體連接并轉入DH5α細胞,在不含AMP+的液體培養基中振蕩培養45 min,取少許液體均勻涂抹于含有AMP+、X-Gal和IPTG的LB固體培養基上,37 ℃培養過夜。采集單個的白色菌落,置入含有AMP+的100 mL LB液體培養基中搖菌10 h,吸菌液做PCR,提取大小與目的條帶一致的菌液質粒,進行Sanger測序。

1.7 生物信息學分析

合作豬StAR基因生物信息學分析工具參見表2。

表2 生物信息學分析工具

2 結果與分析

2.1 StAR基因克隆及測序

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得特異性條帶,與預期片段大小一致(圖1)。測序后發現CDS區長858 bp,編碼285個氨基酸,其中第572位點處的A突變為G,導致第191位點的賴氨酸突變成精氨酸,為錯義突變,第791位點處插入1個堿基C,導致隨后20個氨基酸發生突變,為移碼突變(圖2,3)。

圖1 合作豬StAR基因PCR擴增

圖2 合作豬StAR基因測序結果分析

圖3 合作豬StAR蛋白氨基酸序列比對

2.2 StAR基因同源性分析及系統進化樹構建

下載人(NM_000349.3)、綿羊(NM_001009243.1)、狗(NM_001097542.1)、黑猩猩(XM_009455195.3)、家鼠(NM_011485.5)、馬(NM_001081800.3)、獼猴(NM_001265769.1)、黃牛(NM_174189.3)、豬(NM_213755.2)和雞(NM_204686.2)的核苷酸序列,使用Blast軟件分析合作豬StAR基因的同源性(表3),用MEGA 7.0軟件構建StAR基因的進化樹(圖4)。結果發現,合作豬與豬的親緣關系最近,其次為黃牛和綿羊,與家鼠的親緣關系最遠。

圖4 StAR基因系統進化樹分析

表3 合作豬StAR基因與其他物種序列比對

2.3 StAR蛋白理化性質分析

使用ProtParam軟件預測合作豬StAR蛋白的理化性質。結果顯示,分子式為C1391H2277N415O412S13,原子總數4 453,分子量90.95 ku,理論等電點(pI)8.87,消光系數(γ=280 nm)33 835,不穩定系數41.49,理論半衰期30 h,親水性平均值-0.278。氨基酸殘基中亮氨酸(11.6%)和精氨酸(8.5%)比例較高,帶負電荷的天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基31個,帶正電荷的精氨酸殘基和賴氨酸殘基36個(圖5)。

圖5 合作豬StAR蛋白的氨基酸組成及頻率

2.4 StAR蛋白二、三級結構預測

運用在線軟件SOPMA預測合作豬StAR蛋白二級結構,發現二級結構由17.49%的延伸鏈、5.94%的β-轉角、39.51%的α-螺旋和37.06%的無規則卷曲構成(圖6-A)。采用在線軟件SWISS-MODEL預測其三級結構,發現三級結構主要由α-螺旋、無規則卷曲構成(圖6-B),與二級結構預測基本一致。

h.α-螺旋;t.β-轉角;c.無規則卷曲;e.延伸鏈。

2.5 StAR蛋白親疏水性分析

運用ExPASy在線軟件Protscale分析合作豬StAR蛋白的親/疏水性,氨基酸序列中第100位出現最小疏水值(-3.111),第200位出現最大疏水值(2.122),疏水性氨基酸殘基少于親水性氨基酸殘基,推測為親水性蛋白(圖7)。

圖7 合作豬StAR蛋白的疏水性分析

2.6 StAR蛋白跨膜區域及信號肽分析

采用TMHMM軟件分析跨膜區域,預測期望值為0,無跨膜區域,是非跨膜蛋白(圖8-A)。使用SignalP軟件預測信號肽,發現剪切位點分值(Y)為0.152,信號肽酶切位點分值(C)為0.162,信號肽(S)的分值為0.312,該蛋白不存在信號肽,推測不是分泌蛋白(圖8-B)。

圖8 合作豬StAR蛋白的跨膜區域(A)及信號肽(B)

2.7 StAR蛋白結構域預測

使用SMART軟件預測合作豬StAR蛋白結構域的位置和種類,發現在76—282位氨基酸殘基之間有一個START結構域,屬于SRPBcc結構域蛋白超家族(圖9)。

圖9 合作豬StAR蛋白保守結構域預測

2.8 StAR蛋白糖基化修飾位點及亞細胞定位預測

通過NetNGlyc 1.0軟件預測StAR蛋白糖基化修飾位點,發現第148位氨基酸處存在1個N-糖基修飾位點(圖10-A)。采用PSORTⅡ軟件對合作豬StAR蛋白進行亞細胞定位,發現分布在線粒體(52%)、細胞質(26%)、細胞核(18%)和分泌系統的囊泡(4%),推測是線粒體轉運蛋白(圖10-B)。

圖10 合作豬StAR蛋白N-糖基化位點及亞細胞定位

2.9 StAR蛋白相互作用分析

通過STRING 11.5軟件分析發現,StAR蛋白可能與FSHR、VDAC1、CERS6、NR5A1、TSPO等蛋白有相互作用(圖11)。

圖11 合作豬StAR蛋白網絡互作分析圖

2.10 StAR基因在合作豬各組織中的表達量

使用RT-qPCR檢測StAR基因在合作豬不同組織中的表達水平,發現所有組織均表達,肺臟表達量最高,其次睪丸,且極顯著高于脾臟、腎臟等組織(圖12)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結論與討論

類固醇激素合成能力是影響畜禽繁殖力的重要因素之一。StAR基因編碼的蛋白產物是類固醇激素合成過程中的重要限速酶,表達于腎上腺、卵巢﹑睪丸、胎盤等組織,對畜禽繁殖性狀(如性別分化、精子發生、卵泡發育)有重要功能[19-21]。StAR-/-小鼠卵巢有早衰癥狀,具體表現為脂質沉積﹑基質細胞黃素化、卵泡不完全成熟等[13];胚胎期StAR基因在動物睪丸間質細胞前體的胞間隙中表達,隨后在間質細胞中大量表達,在支持細胞中微量表達,最終影響生殖活動[7]。研究發現,人StAR基因序列的突變可引起腎上腺和性腺類固醇激素合成受阻,表現為脂樣腎功能增生綜合征[22],雞StAR基因序列的突變影響膽固醇轉運蛋白(如ABCA1、ABCG1)的表達量,引起膽固醇激素合成受阻,導致生殖機能異常[23]。以上研究表明,StAR基因對動物繁殖性狀上有重要功能,其核酸序列突變可引起蛋白質功能的改變,影響動物繁殖。

目前,關于合作豬StAR基因相關研究未見報道,為獲取合作豬StAR基因相關信息,本試驗以合作公豬睪丸組織cDNA為模板,克隆該基因,發現CDS全長858 bp,編碼285個氨基酸。劉宇等[5]發現牦牛StAR基因CDS全長858 bp,編碼285個氨基酸,與本研究得到的結果一致。StAR基因的突變會引起類固醇激素含量的改變,影響睪丸功能[7,20]。本研究發現,與豬參考序列相比,合作豬StAR基因共有2處突變,第572位點處的A突變成G,導致第191位的賴氨酸突變成精氨酸,為錯義突變,第791位點處插入一個堿基C,引起C端的20個氨基酸改變,為移碼突變。推測合作豬StAR蛋白中21個氨基酸的改變,可提高蛋白活性,高效轉運更多膽固醇進入內膜生成睪酮等類固醇激素,保證生活在高寒低氧環境中合作公豬正常的繁殖性能。為證實這種推測,今后將在細胞(如睪丸間質細胞)水平過表達正常StAR基因(對應野生型蛋白)及StAR基因突變(對應突變型蛋白),檢測細胞合成類固醇激素的速率及含量。

StAR基因與豬同源性最高,遺傳距離最近,親緣關系最近,與黃牛﹑綿羊具有較高的同源性,在進化上是比較保守的。Bauer等[24]對魚類、哺乳動物等StAR蛋白氨基酸序列做了比較﹐也發現該蛋白質在不同種類動物中具有很強的保守性,與本研究結果一致。StAR蛋白羧基端有一個START結構域,各物種間十分保守,在膽固醇運輸過程中有重要功能,本研究也發現StAR蛋白在76—282位氨基酸處有一個START保守結構域。合作豬StAR蛋白是不穩定的親水性蛋白,定位在線粒體,這與楊沛方等[25]在單、多羔黔北麻羊母羊性腺組織中StAR基因的研究結果一致。StAR蛋白互作網絡圖顯示,其與VDAC1(電壓依賴性陰離子通道1)等蛋白相互作用。VDAC屬于線粒體孔道蛋白,參與多種細胞代謝物/離子的跨膜轉運。Bose等[26]研究發現,腎上腺細胞中磷酸化StAR蛋白能與線粒體外膜上的VDAC1蛋白相互作用,能促進37 ku磷酸化StAR蛋白到32 ku中間體的加工。采用RT-qPCR檢測該基因在合作豬不同組織中的表達豐度,結果發現,睪丸表達量較高,與StAR蛋白的功能及睪丸是類固醇激素主要來源的內分泌特性相吻合。

本研究克隆了合作豬StAR基因,CDS區長858 bp,編碼285個氨基酸,是親水性蛋白,有典型的START結構域,物種間十分保守,睪丸表達量較高。表明StAR基因在合作豬睪丸發育及性成熟過程中發揮了重要功能,此研究為進一步解析合作豬StAR基因發揮功能的分子調控機制提供了參考。