牛病毒性腹瀉病毒NS3基因的生物信息學分析、蛋白純化及免疫原性分析

楊寧寧,徐明國,張江偉,易繼海,陳創夫,3

(1.石河子大學 動物科技學院,新疆 石河子 832003;2.鐵門關職業技術學院 畜禽智能養殖,新疆 鐵門關 836000;3.西部地區高發人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心,新疆 石河子 832003)

牛病毒性腹瀉是病牛以腹瀉為主要特征的免疫抑制性傳染病,病原為牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV),該病廣泛分布于世界各地[1-2]。1946年,Olafson等[3]在紐約州的消化道潰瘍和下痢為主要特征的病牛中首次發現了BVDV,并于1957年成功分離獲得了該毒株。根據BVDV能否引起宿主細胞病變,可將其分為致細胞病變型(Cytopathic,CP)和非致細胞病變型(Noncytopathic,NCP),這2種生物型都有致病性,但只有NCP毒株可以引起牛的持續性感染(Persistent infection,PI)[4]。根據核苷酸序列的差異及交叉中和反應,可以將BVDV分為BVDV-Ⅰ 和BVDV-Ⅱ 2個基因型[5-6]。BVDV-Ⅰ 型毒株常被用于實驗室研究和疫苗研發。根據BVDV-Ⅰ 型基因組5′UTR、Npro和E2核苷酸序列的差異,可將其分為23個亞型(1a～1w);根據BVDV-Ⅱ 型5′UTR差異,可將其分為4個亞型(2a～2d)[4]。2004年,在巴西收集的一批胎牛血清中分離出了全新瘟病毒(HoBi樣瘟疫病毒株或者BVDV-3),該基因型可分為2個基因亞型(Brazilian源和Thai源)[4,7-9]。BVDV的基因組結構為5′UTR-Npro-C-Erns(E0)-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3′UTR,其中C、Erns、E1、E2 為BVDV的結構蛋白(Structural proteins),其余為非結構蛋白(Non-structural proteins,NS)。其中非結構蛋白NS3不僅對BVDV的復制具有重要作用,而且與BVDV是否致細胞病變關系密切[10-11]。且因其具有高度保守性常被作為診斷靶標,但對其是否具有免疫原性的報道較少[12]。因此,本研究以NS3蛋白為研究對象,初步探討了其免疫原性,以期為BVDV亞單位疫苗的研發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物、菌株和血清 4～6周齡的SPF級 BABL/c 小鼠購自新疆醫科大學動物實驗中心; BL21(DE3)和DH5α大腸桿菌感受態細胞購自北京全式金生物技術股份有限公司;pET-22b(+)表達載體、BVDV陽性血清和BVDV毒株均由石河子大學人獸共患病實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自寶生物工程有限公司;蛋白 Marker購自康為世紀生物有限公司;增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒和質粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司;NC膜(0.45 μm)購自Milipore公司;ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit購自諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司;BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo Fisher Scientific; HRP標記的兔抗牛IgG抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;HRP標記的Goat Anti-Mouse IgG、IgG1和IgG2a購自Abcam公司;IPTG溶液(50 mg/mL)購自北京索萊寶公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BVDV NS3蛋白的生物信息學分析 根據NCBI GenBank核苷酸序列數據庫公布的BVDVNS3基因氨基酸序列(GenBank登錄號:MK102095.1),對NS3蛋白的抗原性、理化特性、跨膜結構域、信號肽、二級結構、三級結構和B細胞抗原表位分別進行在線預測分析,分析軟件如表1。

1.2.2 引物設計與合成 根據GenBank公布的BVDVNS3基因序列(GenBank登錄號:L27997.1),利用CE Design軟件設計擴增引物,引物序列:NS3-F 5′-TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTCCTGCTGTGTGCAAAAAGATTACC-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點)和NS3-R 5′-CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCAGGCCCACCACCTGTTTCAGTGCTTT-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點),引物序列送北京睿博興科生物技術有限公司合成。

1.2.3 目的基因的擴增與回收 提取BVDV毒株的總RNA并制備 cDNA,利用特異性引物對cDNA進行PCR擴增,擴增產物經1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,切取目的基因條帶使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化。

表 1 生物信息學分析軟件

1.2.4 pET-22b(+)-NS3重組表達載體的構建與鑒定 將純化的目的基因無縫克隆至pET-22b(+)表達載體,連接體系:目的基因2 μL,pET-22b(+)線性化載體 2 μL,2×ClonExpress Mix 5 μL,補充ddH2O 至10 μL,振蕩混均并離心。反應條件:50 ℃ 15 min,4 ℃ 10 min。連接產物轉化至DH5α感受態細胞中,并均勻地涂于含有氨芐抗性的LB固體培養板,放入37 ℃恒溫過夜培養,無菌操作挑取單克隆菌并擴繁。經PCR和限制性內切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)鑒定正確的菌液送至公司測序。測序正確的重組質粒轉入BL21(DE3)感受態細胞中,均勻地涂于含有氨芐抗性的LB固體培養板,放入37 ℃恒溫過夜培養,無菌操作挑取單克隆菌并擴繁。經PCR 鑒定正確的菌液與甘油(50%)按1∶1的比例混合,保存于-20 ℃。

1.2.5 NS3重組蛋白的表達與純化 將保存的pET-22b(+)-NS3重組表達菌接種至含氨芐抗性的LB液體培養基中,37 ℃恒溫振蕩培養至OD600≈0.6～0.8時加入IPTG(終濃度為1.0 mmol/L),繼續培養,分別于2,4,6,8 h各時間段抽取菌液進行SDS-PAGE電泳檢測,以確定 NS3重組蛋白表達的最佳誘導時間和可溶性分析。菌液超聲破碎后利用鎳親和層析方法進行蛋白純化。

1.2.6 NS3重組蛋白的Western Blotting檢測 純化的NS3重組蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳后,通過半干式碳板轉運電泳儀轉運至NC膜上。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h; BVDV陽性血清為一抗(1∶200),4 ℃過夜孵育; HRP標記的兔抗牛lgG為二抗(1∶4 000),37 ℃孵育1 h;用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。

1.2.7 小鼠免疫 隨機將12只BABL/c小鼠分為2組(NS3重組蛋白免疫組和PBS免疫陰性對照組),每組6只。免疫組每只小鼠接種100 μL NS3重組蛋白(1 mg/mL)+100 μL弗氏完全/不完全佐劑,間隔14 d使用同等劑量加強免疫1次。分別在第0,7,14,21,28,35,42,49,56天尾靜脈采集小鼠血液,并分離血清,保存于-20 ℃備用。

1.2.8 ELISA 檢測小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a 抗體水平 按提前摸好的條件稀釋NS3重組蛋白,包被于96孔ELISA板,每孔100 μL,4 ℃包被過夜;第2天,移棄包被液,每孔分別加入100 μL 5% 脫脂奶粉,并于37 ℃恒溫培養箱中封閉1 h;PBST洗板3次,將100 μL小鼠血清(1∶500)加入相應96孔板中,每個時間點各組隨機選取3個小鼠血清,每個小鼠血清做3次重復,再次37 ℃孵育1 h;1×PBST洗板3次,分別加入100 μL HRP標記的Goat Anti-Mouse IgG、IgG1和IgG2a(1∶2 0 000),37 ℃孵育1 h;1×PBST 洗板3次,每孔加入100 μL的TMB顯色液,37 ℃避光15 min;最后每孔分別加入50 μL ELISA終止液終止反應,用酶標儀讀取OD450處的值。

1.2.9 小鼠血清中和抗體檢測 分別取50 μL免疫后14,28,42,56 d的小鼠血清,56 ℃水浴滅活30 min,并用RIPA-1640完全培養基做2倍倍比稀釋(2-1～2-8),然后用等體積的TCID50BVDV病毒液混合,37 ℃ 孵育 2 h。將MDBK細胞均勻地鋪在96孔細胞培養板中,當細胞密度達80%左右時,吸棄培養液,PBS洗3次,一對一加入孵育后的病毒和血清混合液,PBS免疫組小鼠血清作為陰性對照。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況,并做好記錄。

2 結果與分析

2.1 NS3蛋白的生物信息學分析結果

2.1.1 NS3蛋白的抗原性和理化特性分析 通過VaxiJen v2.0服務器預測NS3蛋白的免疫原性,發現總體預測保護性抗原評分為 0.587 3,表明NS3蛋白具有較好的免疫原性;NS3蛋白有683個氨基酸構成;分子質量為75.304 33 ku;理論等電點(PI)為8.15;在大腸桿菌中的半衰期>10 h,且不穩定性指數為35.23,表明該蛋白為穩定蛋白質。

2.1.2 NS3蛋白的跨膜結構域和信號肽分析 NS3蛋白的跨膜結構域和信號肽分別利用TMHMM Serverv.2.0和SignalP 4.1 server在線軟件分析,結果發現NS3蛋白無跨膜結構域和信號肽序列(圖1,2)。

圖1 NS3蛋白跨膜結構域預測

圖2 NS3蛋白信號肽預測

2.1.3 NS3蛋白的二級結構和三級結構模型預測 NS3蛋白的二級結構利用SOPMA在線軟件預測分析,發現NS3蛋白的二級結構中(圖3),α-螺旋由209個氨基酸,占30.60%;延伸鏈由149個氨基酸,占21.82%;β-轉角由62個氨基酸,占9.08%;無規則卷曲由263個氨基酸,占38.51%,表明NS3蛋白的二級結構主要以無規則卷曲為主。NS3蛋白的三級模型利用phyre 2在線軟件構建(圖4)。

圖3 NS3蛋白的二級結構預測

圖4 NS3蛋白的三級結構預測模型

2.1.4 NS3蛋白的B細胞抗原表位預測 抗原表位指蛋白質表面由6～12個氨基酸或碳水基團組成并且具有刺激機體產生抗體的區域。利用IEBD軟件對NS3蛋白的優勢抗原表位進行預測,結果發現其有20個優勢抗原表位,分別在第7—16,23—33,46—49等氨基酸片段區(表2)。表明NS3蛋白整體抗原性較好,具有作為疫苗及診斷抗原的潛力。

表2 預測多肽

2.2 目的基因的擴增

PCR 反應以 BVDV 毒株的 cDNA 為模板,以NS3-F 和NS3-R 為引物,經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物,在約2 049 bp處出現一條條帶(圖5)。測序結果比對發現,與GenBank公布的BVDVNS3基因序列達到100%的同源性,表明成功獲得目的基因片段。

M.DM10000 Marker;1.陰性對照;2—3.NS3目的基因。

2.3 pET-22b(+)-NS3重組質粒酶切鑒定

將pET-22b(+)-NS3重組質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞中,挑取單克隆菌并擴增,提取質粒用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現與目的基因大小相符的條帶(圖6),表明NS3基因與pET-22b(+)載體已相互連接,即成功獲得pET-22b(+)-NS3重組質粒。

M.1 kb DNA Marker;1.pET-22b(+)質粒;2.pET-22b(+)-NS3重組質粒雙酶切。

2.4 NS3重組蛋白的誘導表達和可溶性分析

將pET-22b(+)-NS3菌液接種到LB液體培養基中誘導表達,經SDS-PAGE電泳分析,結果顯示,在75 ku處出現一條與NS3蛋白大小相符的蛋白條帶,且隨誘導時間的延長,蛋白表達量逐漸增高,表明NS3蛋白成功表達,最佳誘導時間為8 h(圖7-A)。SDS-PAGE 電泳分析超聲破碎后的上清和沉淀,結果顯示,NS3重組蛋白在沉淀中含量較高,說明該蛋白主要以包涵體的形式進行表達(圖7-B)。

A:M.蛋白質分子質量標準;1—5.pET-22b(+)-NS3 37 ℃ 誘導0,2,4,6,8 h的菌液。B:M.蛋白質分子質量標準;1.破碎后菌液沉淀;2.破碎后菌液上清液。

2.5 NS3重組蛋白的純化與Western Blotting檢測

按照His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)步驟對NS3重組蛋白進行純化,經SDS-PAGE電泳分析得到了純度較高的NS3重組蛋白(圖8)。純化的蛋白Western Blotting驗證,結果顯示,在約75 ku處出現明顯的反應條帶(圖9),表明純化的NS3重組蛋白能夠與BVDV陽性血清發生特異性反應。

M.蛋白質分子質量標準;1.純化后的NS3重組蛋白。

M.蛋白質分子質量標準;1—2.純化后的NS3重組蛋白。

2.6 小鼠血清 IgG、IgG1和IgG2a 抗體檢測

免疫小鼠血清中的 IgG、IgG1 和 IgG2a 抗體水平由 ELISA 檢測。結果顯示:與 PBS 陰性對照組相比,NS3重組蛋白免疫組能誘導小鼠產生較高水平的IgG、IgG1和 IgG2a抗體(圖10),表明其具有較好的免疫原性。

A.小鼠血清中IgG抗體水平;B.小鼠血清中IgG1抗體水平;C.小鼠血清中IgG2a抗體水平。

2.7 小鼠血清中和抗體水平

小鼠血清中和抗體結果顯示,一免后14 d,NS3重組蛋白免疫組與PBS陰性對照組相比極顯著高于PBS陰性對照組(圖11),且隨著免疫時間和免疫次數的增加這種顯著性更為明顯。結果表明,NS3重組蛋白制備成的疫苗免疫小鼠后能夠產生高水平的中和抗體,其具有較好的免疫原性。

圖11 免疫小鼠血清中病毒中和抗體檢測

3 結論與討論

BVDV 主要感染牛、羊、豬、鹿等動物,臨床癥狀為精神沉郁、厭食、腹瀉、體溫升高、白細胞數目減少、生產性能下降、懷孕母畜導致流產或產畸形胎兒,偶爾觀察到感染動物口鼻潰爛、便血、腸黏膜脫落等[13-15]。另外,BVDV是牛源生物制品,如血清、凍精和冷凍胚胎等的常見污染源,給畜牧業造成了巨大的經濟損失。

隨著生物技術的快速發展,生物信息學軟件廣泛被用于對蛋白質結構和功能等的分析和預測,可為人工合成蛋白質、疫苗設計和疾病發生機制等方面的研究提供理論依據,能夠有效地減少試驗的盲目性從而節約成本[16-17]。該研究對NS3蛋白的氨基酸序列進行理化特性分析,結果發現:NS3蛋白包含683個氨基酸,分子質量為75.304 33 ku,理論PI為8.15,不穩定性指數為35.23,表明該蛋白為穩定性蛋白質。通過VaxiJen v2.0服務器預測NS3蛋白的免疫原性,發現總體預測保護性抗原為0.587 3,大于0.4的閾值,表明NS3蛋白具有較好的免疫原性。NS3蛋白既沒有跨膜結構域也沒有信號肽,二級結構主要以無規則卷曲為主。通過生物信息學軟件對NS3蛋白進行分析,可以為該基因原核表達菌株的構建提供理論依據,尤其是對進一步的蛋白表達和獲得等具有較好的指導意義。

目前,關于BVDV亞單位疫苗的研究主要集中在E0和E2這2個結構蛋白上,而這2個蛋白屬于糖蛋白,利用原核蛋白表達系統表達容易導致糖基化位點丟失。由于E0和E2基因與NS3基因相比變異較快,因此,目前生產中使用的BVDV疫苗還是以弱毒和滅活疫苗為主[8,18-20]。NS3蛋白具有較高的保守性,這種保守性不僅體現在同種基因型BVDV毒株之間,而且存在于不同基因型之間,因此,國內外學者常利用NS3建立BVDV抗體/抗原檢測方法[21]。然而,目前關于NS3蛋白的研究大多集中在診斷方面,關于其是否可用于疫苗的生產方面研究較少。在BVDV感染過程中,宿主免疫系統的CD4+T細胞可識別NS3蛋白,并誘導其產生特異性的抗體,且該特異性抗體持續時間較長[22-23]。因此,本研究利用原核蛋白表達系統,成功表達并獲得了純度較高的NS3重組蛋白,并將該重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1的比例混合免疫BABL/c小鼠,定期采集免疫小鼠血液,并分離血清。ELISA檢測了小鼠血清中的 IgG、IgG1和 IgG2a抗體水平,發現與PBS陰性對照組相比,NS3重組蛋白免疫組誘導產生了更高水平的IgG、IgG1和 IgG2a抗體。小鼠血清中和試驗發現,自一免后14 d開始,NS3重組蛋白免疫組小鼠產生的中和抗體極顯著高于PBS陰性對照組,且隨著免疫時間和免疫次數的增加這種顯著性尤為明顯。說明由NS3重組蛋白制備成的亞單位疫苗能夠誘導小鼠產生高水平的特異性抗體和中和抗體,表現出較好的免疫原性,從而推斷其可作為 BVDV 亞單位疫苗的候選抗原。

本研究對BVDV非結構蛋白NS3進行了生物信息學分析,掌握了其結構與抗原特性,利用原核表達技術成功獲得了具有較高純度的NS3重組蛋白,并將其作為免疫原制備成亞單位疫苗,免疫小鼠后可誘導機體產生高水平的特異性抗體和中和抗體,從而為 BVDV 亞單位疫苗的研發奠定基礎。