黃瓜F-box基因家族的鑒定與生物信息學分析

史艷 肖雅茹 李麗霞 李梅蘭

關鍵詞：黃瓜；F-box基因家族；生物信息學；表達分析

植物在生長過程中常受環境帶來的脅迫傷害，在此過程中進化出多種調節機制來保障其生命活動的正常進行，其中，F-box蛋白參與的泛素-蛋白酶體途徑（UPP）是最重要的調節機制之一[1]，可參與細胞內80%以上蛋白質的降解，從而防御和緩解脅迫帶來的損傷[2]。由Skp1、Cullin1、F-box構成的E3泛素連接酶復合物（SCF）是UPP途徑關鍵組分[3]，其中含有F-box結構域的F-box蛋白可特異性識別底物并與之結合，參與調控胞內蛋白降解、受體識別、信號傳導等生物學過程[4-6]。

F-box基因廣泛存在于各種植物中，其家族鑒定的重要標識是F-box結構域，該結構域在物種進化中較為保守，由位于N端的40～50個氨基酸組成，可與C端其他結構域結合共同發揮作用[7]。隨著第1個F-box基因UFO（Unusualfloralorgans）在擬南芥中被鑒定[8]，對F-box基因的研究越來越深入，例如，F-box蛋白ACRE189/ACIF1通過調節茉莉酸和脫落酸的基因表達來參與防御反應[9]；葡萄中分離出的F-box基因（BIG-24.1）在葡萄葉片感染灰霉病期間高表達，使植株表現出抗性增強[10]；水稻F-box蛋白MoFwd1與MoSkp1相互作用，抑制分生孢子萌發，從而降低稻瘟病菌的致病性[11]。目前F-box基因家族已經在玉米[12]、小麥[13]、陸地棉[14]、番茄[15]、蠶豆[16]等作物中進行了全基因組鑒定及詳細分析，但在主要蔬菜作物黃瓜（CucumissativusL.）中的研究較少。

本研究基于黃瓜基因組數據，利用生物信息學方法鑒定黃瓜F-box基因家族成員，系統分析了其基因結構、染色體定位、保守基序、蛋白質理化性質和結構、順式作用元件及系統進化關系等特性，以及在不同生物脅迫下的表達模式，為進一步探究黃瓜F-box家族基因功能奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 黃瓜F-box基因家族獲取與鑒定

從Pfam數據庫查找下載擬南芥F-box保守結構域（Pfam號：PF00646）文件，在葫蘆科作物基因組網站（http：//cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜的全基因組數據（cucumber_ChineseLong_v2_genome.fa）和蛋白質數據（cucumber_ChineseLong_v2_pep.fa）。通過HMMER3.0軟件查找含有F-box保守結構域的黃瓜基因，設置E-value<10-5，作為F-box基因家族的候選成員。利用TBtools軟件調取候選家族成員的氨基酸序列，通過NCBI中的CD-search功能鑒定候選成員保守結構域的完整性并去除冗余，具有完整F-box結構域的候選基因即為黃瓜F-box基因家族成員。

1.2 黃瓜F-box基因染色體定位分析

從葫蘆科作物基因組網站下載黃瓜基因的gff文件，通過TBtools軟件調取基因位置信息，利用在線網站MG2C-v2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖并進行修飾。

1.3 黃瓜F-box基因結構和Motif分析

將F-box家族基因的CDS和基因全長的fasta文件導入GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）進行黃瓜F-box基因結構分析。使用在線網站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行保守基序分析，Motif參數設置為10[17]，并利用TBtools軟件對黃瓜F-box蛋白的保守基序進行可視化。

1.4 黃瓜F-box蛋白理化性質分析

將篩選出的F-box家族成員通過TBtools軟件調取其氨基酸序列，并利用在線網站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）進行理化性質的分析。

1.5 黃瓜F-box基因家族亞細胞定位與二、三級結構預測

通過在線網站Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）對黃瓜F-box基因家族蛋白進行亞細胞定位。利用SPOMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線分析工具分析蛋白質的二級結構。通過在線網站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.Expasy.org/）對黃瓜F-box基因家族的蛋白質序列進行三級結構模型預測。

1.6 黃瓜F-box基因家族啟動子順式作用元件分析

利用在線分析網站PlantCARE（http：//bioin?formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中的SearchforCARE功能對黃瓜F-box基因家族起始密碼子ATG上游2000bp的序列進行啟動子順式作用元件分析。

1.7 黃瓜F-box基因家族系統進化樹分析

將黃瓜F-box基因家族的氨基酸序列使用MEGA7.0軟件利用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，bootstrap設為1000[18]。利用在線網站iTOL（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。

1.8 黃瓜F-box基因的表達模式分析

利用前人報道的黃瓜RNA-seq數據信息，獲取黃瓜在霜霉菌[19]和丁香假單胞菌[20]脅迫下F-box家族基因的表達量（每百萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數，RPKM）信息，進行基因表達模式分析，以探討F-box家族基因在防御生物脅迫方面的調節機制。

2 結果與分析

2.1 黃瓜F-box基因家族成員鑒定與染色體定位分析

根據擬南芥F-box保守結構域信息在黃瓜基因組數據庫篩選，并驗證候選基因蛋白序列的保守性，結果顯示，有22個與F-box保守結構序列高度匹配的蛋白序列（E-value<10-5），且不均勻分布在黃瓜7條染色體上（圖1）。其中，4號染色體上被定位的基因最多，為6個，其次是3號染色體上有4個基因，1號、5號和6號染色體分別含有3個基因，2號染色體有2個基因，7號染色體有1個基因。依據22個基因在染色體上的排列順序，依次命名為CsF-box01～CsF-box22。

2.2 黃瓜F-box基因結構和蛋白保守基序分析

對22個家族成員進行基因結構分析，由圖2可知，不同基因的長短各異，所含的外顯子和內含子的數目和位置也存在差異。其中，有8個基因為斷裂基因，外顯子數目為2～10個；CsF-box12基因長度最長，且外顯子個數最多；除基因CsF-box13、CsF-box11外，其余基因兩端均含有上游或下游結構。對黃瓜22個F-box基因進行多重序列比對和系統進化分析后，22個F-box基因劃分為3類。根據進化關系的遠近分析，位于同一分支上的基因結構具有相似性，例如第一類（CsF-box02、CsF-box06、CsF-box08、CsF-box10、CsF-box15、CsF-box17、CsF-box20、CsF-box21）的基因均只含有1個外顯子無內含子，除基因CsF-box02外，其余基因兩端均含有上游和下游結構。這說明黃瓜F-box基因家族在進化過程中是相對保守的。

對黃瓜F-box基因家族成員的保守基序進行分析，共鑒定出10個保守基序（圖2），命名為Motif1～Motif10。除CsF-box13外，其余家族成員均含有Motif1，說明F-box基因家族相對保守。基于進化關系，家族成員可分為3類，每一類的基因保守基序具有相似性，第1類基因含有的Motif種類最多，為4～8個；第2類種類最少，除CsFbox09、CsF-box13外，均只含有Motif1和Motif10；第3類中，除CsF-box11只含有Motif1外，其余均含有Motif10、Motif4和Motif2。

2.3 黃瓜F-box蛋白質理化性質分析

對黃瓜F-box基因家族的編碼蛋白進行理化性質分析，結果顯示（表1），黃瓜F-box基因家族的編碼蛋白的氨基酸數目和分子質量變化一致，其中，CsF-box14氨基酸數和分子質量最小，最大的是CsF-box19；等電點為5.10～9.71，有12個酸性蛋白，10個堿性蛋白；不穩定系數為33.59～62.59，其中，CsF-box01、CsF-box15、CsF-box21的不穩定系數小于40，為穩定蛋白，其余均為不穩定蛋白；親水系數顯示，有20個家族成員的親水系數為負值，編碼蛋白為親水蛋白，2個成員為正值，為疏水蛋白。

2.4 黃瓜F-box蛋白亞細胞定位及二、三級結構預測

對黃瓜F-box基因家族編碼蛋白的亞細胞定位結果分析（表2），發現有5個家族成員的編碼蛋白被定位到細胞核中，12個被定位到細胞質中，3個被定位到線粒體中，CsF-box06編碼蛋白被定位到細胞核和細胞質中，CsF-box10編碼蛋白被定位到細胞質和線粒體中。對F-box基因家族成員進行了二級結構預測（表2），結果顯示，55%家族成員的二級結構主要由延伸鏈和無規則卷曲構成，45%的家族成員主要由α-螺旋和無規則卷曲構成。為了探討蛋白質二級結構預測的準確性，對22個家族成員的三級結構進行模型預測，結果如圖3所示，預測的蛋白三級結構與二級結構基本一致。

2.5 啟動子順式作用元件分析

為了探究黃瓜F-box基因家族的功能，進行了啟動子順式作用元件分析，共鑒定出18個啟動子順式作用元件（圖4）。根據功能不同分為4類，分別為光響應元件（3個）、激素響應元件（5個）、生長發育相關元件（5個）、脅迫響應相關元件（5個）。對啟動子的分析表明，黃瓜F-box基因家族可參與調控黃瓜生長發育和抗逆反應緊密相關的多個代謝通路。

2.6 黃瓜F-box基因家族系統進化樹分析

蛋白的氨基酸序列，與黃瓜22個F-box蛋白序列一起構建系統進化樹，以探討黃瓜F-box基因家族與其他物種的親緣關系。如圖5所示，黃瓜F-box基因家族可分為4個亞組，分別將其命名為第Ⅰ～Ⅳ亞族，每個亞組分別含有3、6、5、8個基因。從整體來看，黃瓜F-box家族成員與擬南芥的親緣關系最近。在第Ⅰ亞組中，CsF-box09與AtF-box18、CsF-box05與AtF-box16分別聚為一小支，親緣關系較近；第Ⅱ亞組中，CsF-box11與AtF-box05、CsF-box13與AtF-box01、CsF-box04與AtF-box12具有很強的同源性；第Ⅲ亞組中，CsF-box01、CsFbox03、CsF-box07、CsF-box22和SmF-box08關系緊密；第Ⅳ亞組中，CsF-box20與SlF-box06、CsFbox17與SmF-box05、CsF-box19與SmF-box04分別聚合在一個分支。

2.7 黃瓜F-box基因在生物脅迫下的表達模式分析

利用前人發表的黃瓜RNA-seq數據庫，提取F-box家族基因表達信息，用于分析黃瓜F-box家族基因對霜霉病的響應模式。結果表明，在霜霉菌脅迫下有8個F-box家族基因在抗性品系IL51（R）和易感品系IL53（S）中差異表達（圖6-A），其中，CsF-box08、CsF-box12、CsF-box21這3個基因隨霜霉菌處理時間增長呈現表達量升高的趨勢，相反地，基因CsF-box01、CsF-box09、CsF-box20和CsFbox14則隨處理時間增長呈現出表達量下降的趨勢。這說明該家族基因參與了霜霉菌侵染早期的響應途徑，但其響應模式存在較大差異，基因間還可能存在拮抗作用。值得注意的是，基因CsFbox04只在抗性品系中表達量較高，而在易感品系中表達量較低，且在同品系內霜霉菌處理后的差異并不明顯，因此，推測該基因可能是導致IL51和IL53對霜霉菌產生不同抗性的原因之一。

根據已發表的黃瓜細菌性葉斑病的轉錄組數據，提取丁香假單胞菌接種0、1d抗性品系Gy14和感病品系B10的基因表達信息，以探討F-box家族基因在丁香假單胞菌脅迫早期的表達模式。結果發現，有2個F-box家族基因在抗性品系Gy14和感病品系B10中差異表達（圖6-B）。其中，CsF-box09基因在Gy14和B10未接種丁香假單胞菌時表達量較高，但在接種1d時表達量較低；相反地，CsFbox10基因在未接種丁香假單胞菌時表達量較低，而接種1d時表達量較高。因此，推測CsF-box09可能負向調控黃瓜對細菌性葉斑病的抗性，而基因CsF-box10則與之相反，可能在調控黃瓜細菌性葉斑病抗性方面起積極作用。

3 結論與討論

本研究通過生物信息學分析發現，黃瓜F-box基因家族編碼蛋白絕大多數為不穩定的親水蛋白，且45%F-box蛋白顯示為堿性，這與油菜[21]和茶樹[22]F-box蛋白理化性質分析結果一致。F-box蛋白亞細胞定位主要位于細胞質中，可能參與了細胞內某些物質的合成與降解，而蘋果[23]和蠶豆[24]中的F-box蛋白主要定位到細胞外，可能參與了胞外某些特定的生物學過程，這種差異可能是由于基因在不同物種進化過程中產生了某種特定功能的分化造成的。根據親緣關系的遠近，位于同一類別的基因結構與保守基序具有相似性，由此推測F-box基因家族成員之間具有較高的保守性。啟動子順式作用元件分析發現，黃瓜F-box基因家族含有大量激素響應相關作用元件，其中，茉莉酸甲酯[25-26]、脫落酸[27-28]、水楊酸[29-30]、生長素[31]、赤霉素[32]是植物獲得抗性的重要調節劑，F-box基因可能是通過參與植物激素信號傳導過程，來響應脅迫反應[33]。

黃瓜在生產過程中常遭遇各種脅迫，其中以霜霉病、細菌性葉斑病、白粉病為代表的葉片病害尤為常見。在病害暴發時，黃瓜輕則減產20%～30%，重則造成毀滅性損害。為探究黃瓜F-box基因在生物脅迫下的作用，對其進行了表達模式分析，結果表明，F-box基因參與了霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫下黃瓜的防御途徑，在一定程度上緩解了生物脅迫帶來的損傷。由進化樹可知，CsF-box01與SmF-box08、CsF-box14與SmF-box02、CsF-box21與SmF-box07親緣關系較近，推測其結構與功能可能存在相似性。其中SmF-box08（Kelch結構域）是茄子對細菌性葉斑病抗性起正調控作用的候選基因[34]；SmF-box02編碼EBF1蛋白[34]，EBF1可抑制乙烯（Eth）的信號傳導[35]；SmF-box07（LRR結構域）在茄子對細菌性葉斑病抗性起負調控作用[34]。基因CsF-box01（含有Kelch結構域）、CsF-box14（編碼EBF1蛋白）、CsF-box21（LRR結構域）在霜霉菌脅迫下差異性表達，因此，推測CsF-box01正向調控黃瓜對霜霉病的抗性，CsF-box14可能通過抑制乙烯信號轉導來調控黃瓜對霜霉病的抗性，CsF-box21可能在黃瓜霜霉病抗性方面起負調控作用。AtF-box18基因編碼EID1蛋白為脫落酸的信號傳導的負調控因子，可增強植物對溫度、干旱、鹽引起的非生物脅迫的抗性[36]。由進化樹可知，基因CsF-box09與AtF-box18聚為一支，具有高度同源性。且CsF-box09在霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫下差異表達，并含有脫落酸反應元件，因此，推測基因CsF-box09可能負調控脫落酸的信號傳導來增強對霜霉病和葉斑病的抗性。CsF-box04同源基因AtF-box12編碼的F-box-Nictaba蛋白被證明是一種可結合N-乙酰乳糖胺的功能性凝集素，可參與水楊酸相關通路的植物防御反應，在擬南芥中過表達該基因可減輕由丁香假單胞菌脅迫造成的傷害[37]。CsF-box04基因含有水楊酸反應元件，并在抗性品系中表達量較高，因此，推測該基因是通過參與水楊酸相關防御通路來增強對病原菌的抗性。

本研究通過生物信息學的方法共鑒定出22個CsF-boxes，其分布在7條染色體上，均含有F-box（PF00646）結構域，大多數成員含有Motif1基序，且在細胞質和細胞核中均有分布。CsF-boxes啟動子區存在大量與激素響應、生長發育和脅迫響應相關順式作用元件。對霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫后葉片中CsF-boxes基因表達模式進行分析，發現分別有8、2個F-boxes基因在病原菌脅迫下差異性表達，其表達模式多樣。其中，CsF-box09與AtFbox18、CsF-box04與AtF-box12為同源基因，且CsF-box09和CsF-box04分別含有脫落酸、水楊酸反應元件，因此，推測CsF-box09負調控脫落酸信號轉導來增強抗病性，CsF-box04則是通過參與水楊酸相關防御通路正向調控黃瓜霜霉病抗性。該結果為深入研究黃瓜F-box基因的生物學功能及響應生物脅迫機制提供了參考。