白腐真菌對鄰苯二甲酸二甲酯的降解與機理研究

高斯研, 崔康平, 劉 睿, 許向陽, 陳長斌, 汪三六

(1.合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009; 2.安徽曙光化工集團有限公司,安徽 安慶 246003)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是一種合成的難降解的有機增塑劑化合物[1],廣泛用于塑料、軟管、玩具、容器等柔性塑料制品的添加劑和增塑劑[2],鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)是最重要和最廣泛使用的PAEs之一[3]。由于不與主體聚合物發生化學結合,DMP易于從塑料中浸出[4],會存在于沉積物、自然水體、廢水、土壤,甚至由于其具有相對較高的蒸汽壓力而存在于空氣中[5]。在環境中,DMP通過食物鏈進入雄性哺乳動物體內,對生殖功能有顯著損害,如破壞生殖系統、引起睪丸萎縮和精子丟失、改變生殖細胞的超微結構等[6-8]。此外,DMP對雌性哺乳動物的胚胎發育有中度毒性。由于DMP存在苯基、羧基,其水解反應半衰期約3 a,不易在自然環境中降解;由于它的誘變、致畸和致癌性及難降解性,中國環境監測總站和美國環境保護署將其列為優先級有機污染物[9]。因此有必要開發有效的降解處理方法降解水生環境中的DMP污染物。

目前,降解DMP的主要方法有光化學氧化法、預氧化法[10]和生物降解法[11]。由于生物降解法具有低能耗、低成本和可忽略的二次污染等優勢,已成為有機化合物污染環境修復的研究熱點。生物處理是通過微生物代謝降解和轉化有害物質,具有高效和環境相容性等特點[12],酯類烴鏈較短的PAEs更容易被微生物降解和礦化[13]。因此,尋找有效率的DMP降解菌被認為是清除土壤中DMP殘留的首要步驟。目前,分離到的降解DMP的細菌大部分是原核微生物,包括不動桿菌、節桿菌、芽孢桿菌、短桿菌、乳酸菌、巴氏桿菌、黃單胞菌、假單胞菌、白念珠菌、紅球菌等[14-17],而真菌降解DMP的相關研究較少。

白腐真菌針對底物的降解具有廣譜性[18],可以徹底降解多種難降解有機污染物,而相關實驗研究表明,利用白腐真菌降解廢水中的金屬,可以大大提高廢水的治理效率[19]。因此,白腐真菌具有廣泛的降解能力、營養物質要求簡單、生命力頑強、降解徹底、培養成本低廉及對固液基質的適應性強[20]等特點,在水污染防治中具有成本低、效率高、實用性強等優勢[21]。黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是白腐真菌的一種,因其能產生錳過氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)和木質素過氧化物酶(lignin peroxidase,LiP),通過氧化還原反應來攻擊多種污染物而受到研究人員關注[22]。白腐真菌具有生物量大、對周圍需要修復的生態環境要求低、適應性強的特點,因此多被應用于降解各種芳烴類化合物及農藥,其在降解這些物質方面表現出卓越的性能[23-24]。目前,白腐真菌已廣泛應用于紡織、紙漿造紙廢水的修復等領域[25-27]。

目前,微生物降解PAEs的研究主要集中在細菌降解方面,包括好氧和厭氧細菌,而真菌對PAEs生物降解的研究報道很少。本文將黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium)作為白腐真菌的代表,研究白腐真菌P.chrysosporium對塑化劑中DMP的活化降解條件和機理。具體研究內容如下:① 探討溫度、pH值、DMP的初始質量濃度、葡萄糖質量濃度、H2O2用量和Mn2+用量對DMP降解效率的影響;② 研究白腐真菌P.chrysosporium/DMP體系的機理,包括MnP酶和LiP酶的測定;③ 利用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)測定白腐真菌P.chrysosporium反應前后官能團的變化,用液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)聯用儀鑒定DMP的降解產物并討論其降解途徑。

1 實 驗

1.1 黃孢原毛平革菌的培養

從中國培養物保藏中心(武漢)購得白腐真菌P.chrysosporiumAF-96007菌株,每30 d在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(馬鈴薯提取物200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L)上傳代1次,傳代后將培養基置于恒溫培養箱中,在30 ℃活化7 d后在4 ℃條件下保存。液體培養時,取出4 ℃下保存的白腐真菌P.chrysosporium,將孢子刮到滅菌后的超純水中,調節濁度為100 FTU。在高溫滅菌后的200 mL液體培養基中接種3 mL孢子懸浮液,置于30 ℃、135 r/min的條件下培養3 d,待菌球進入對數培養期后,投加污染物。液體培養基所含組分如下:

葡萄糖5 g/L、KH2PO42 g/L、

MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.1 g/L、

MnSO40.03 g/L、NaCl 0.06 g/L、

FeSO4·7H2O 6 mg/L、CoCl26 mg/L、

ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO46 mg/L、

AlK(SO4)2·12H2O 0.6 mg/L、

H3BO30.6 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.6 mg/L、

酵母提取物0.012 g/L、酒石酸二銨0.2 g/L、

維生素B11 mg/L、藜蘆醇0.07 g/L、

吐溫-80 0.5 g/L。

用1.2 g/L醋酸鈉調節溶液pH值至4.5。

1.2 最佳降解條件研究

為了提高白腐真菌P.chrysosporium對DMP的降解效率,探究DMP初始質量濃度、溫度、pH值、葡萄糖質量濃度、H2O2用量、Mn2+用量對DMP降解效率的影響。

1) 實驗組。待孢子懸浮液培養3 d后,分別投加一定量的DMP儲備液,其初始質量濃度分別為1、5、10、15、20 mg/L;培養溫度分別設置在25、30、37 ℃;初始pH值分別設置在3.6、4.6、5.6、6.6、7.6;液體培養基葡萄糖的質量濃度分別為5、10、15、20 g/L;在錐形瓶中加入一定體積的H2O2溶液(1 g/L),以達到所需質量濃度為5、10、20、30 μg/L;在錐形瓶中加入一定體積的Mn2+,使錐形瓶中Mn2+質量濃度分別為5.5、11.0、27.0、40.0 mg/L。將上述實驗組置于恒溫振蕩培養箱中恒溫振蕩培養,每24 h測定體系中DMP質量濃度,通過比較初始和最終DMP質量濃度來計算降解效率,每個樣品設置3個平行。

2) 對照組。空白對照為純培養基,以滅活白腐真菌P.chrysosporium培養基(121 ℃,15 min)處理后DMP質量濃度為吸附對照。

DMP的質量濃度通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測定,采用紫外吸收檢測器和 C18反相色譜柱(5 μm,4.6×150 mm)進行分析。紫外吸收檢測器的波長設置為 225 nm,柱溫為30 ℃,流動相為水和乙腈(水和乙腈的體積比為3∶7),流速為1 mL/min,出峰時間在2.5 min左右,通過外標法進行定量分析。

1.3 酶活的測定

有研究證明,微生物能夠降解有機污染物的原因是其自身能夠分泌可用于降解污染物的酶[28]。在污染物的脅迫下,白腐真菌會分泌出孢外酶,如MnP酶、LiP酶,來參與有機污染物的礦化過程。本實驗探究最適降解條件下處理10 mg/L DMP的對照組以及 27 mg/L Mn2+實驗組中 MnP酶和 LiP酶的活性。

收集實驗組中不同降解時間下的白腐真菌P.chrysosporium菌球,于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,離心后取上清液用于酶活的測定。

MnP酶的活性是用紫外分光光度計測定其在240 nm處吸光度值的變化來表征。3 mL的反應體系包括 0.4 mL 孢外粗酶液、2.0 mL 琥珀酸緩沖液(丁二酸)(5.9 g/L,pH=4.5)、0.5 mL MnSO4(2.265 g/L)及0.1 mL H2O2(0.34 g/L)。25 °C條件下將H2O2作為反應的啟動因子啟動酶反應,記錄在240 nm下分別反應0、3 min時的吸光度值,定義每min產生1 μmol Mn3+所需要的 MnP 酶量為1個酶活單位。

LiP酶活性是用紫外分光光度計測定其在310 nm處吸光度值的變化來表征。3 mL的反應體系包括0.4 mL孢外粗酶液、1.5 mL 的酒石酸緩沖液(15 g/L,pH=3.0)、1.0 mL 藜蘆醇(1.82 g/L)及0.1 mL H2O2(0.34 g/L)。25 ℃條件下將H2O2作為反應的啟動因子啟動酶反應,記錄在310 nm下分別反應0、3 min時的吸光度值,將每min內1 μmol藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量作為1個酶活單位。

MnP、LiP 酶活的計算公式為:

其中:ΔA為吸光度最大和最小峰之間的差;V1為反應體系的體積,取值為3 mL;Δt為ΔA對應的時間差;V2為酶液體積,取值為0.4 mL;b為比色皿厚度,取值為1 cm;ε為吸光系數,Mn3+的吸光系數為8 100 L/(mol·cm),藜蘆醛的吸光系數為9 300 L/(mol·cm)。

1.4 降解機理研究

1.4.1 傅里葉紅外光譜分析

為了鑒定白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的過程中起主要作用的官能團種類,利用FTIR定性分析白腐真菌P.chrysosporium降解DMP反應前后官能團的變化。取對照組(菌體+10 mg/L DMP)分別降解反應 0、5 d 后的菌體,用超純水清洗5次后于-60 ℃冷凍干燥機中干燥24 h后,取出將其碾碎。稱取約0.1 g研磨后的樣品、約0.1 g KBr 粉末,混合均勻后制成半透明壓片。檢測時,儀器的波數范圍為4 000～500 cm-1。

1.4.2 中間產物鑒定

溶液中DMP降解的中間產物使用LC-MS分析。液相色譜條件如下:C18 反相色譜柱,流動相為水(A相)和乙腈(B相)(水和乙腈的體積比為3∶7),流速為 0.2 mL/min,梯度洗脫 15 min 內A相由95%降至0,然后1 min內 A相再升至95%,最后保持5 min;進樣量為20 μL,樣品DMP質量濃度為10 mg/L。質譜條件如下:負離子模式,保護氣溫度為450 ℃,毛細管電壓為4 500 V,霧化氣壓力為41.37 kPa(6.0 psig),氣簾氣壓力為55.16 kPa(8.0 psig), 碰撞活化解離(collision-activated dissociation,CAD)為11 L/min,離子源氣1(Gas1)為6 L/min,離子源氣2(Gas2)為7 L/min,波長為224 nm。

2 結果與討論

2.1 最佳降解條件研究

本實驗通過探究不同溫度、pH值、DMP初始質量濃度、葡萄糖質量濃度、H2O2質量濃度、Mn2+質量濃度確定DMP生物降解的最佳降解條件。實驗以純培養基為空白對照,以滅活白腐真菌P.chrysosporium培養基(121 ℃,15 min)為吸附對照。

不同溫度、pH值、DMP初始質量濃度、葡萄糖質量濃度、H2O2質量濃度、Mn2+質量濃度對DMP生物降解效率的影響如圖1所示。圖1中,黃孢菌即黃孢原毛平革菌。

圖1 溫度、pH值、DMP初始質量濃度以及葡萄糖、H2O2、Mn2+的質量濃度對DMP降解效率的影響

從圖1a可以看出:DMP降解效率隨溫度升高呈先上升后下降;在30 ℃下,DMP的降解效率達到75%,而其他組的降解效率均低于75%。這可能是由于溫度會顯著影響酶的活性和白腐真菌P.chrysosporium的代謝效率。當溫度較低時,酶的活性不強,污染物降解速率一般,通常溫度每升高10 ℃,反應速率就會加快1倍左右。然而,酶的本質是蛋白質,若溫度過高,則會導致蛋白質的變性,從而使酶失活,酶一旦失活就不能作為促使污染物降解的催化劑,污染物降解效率就會顯著下降。因此,將30 ℃設為后續實驗的溫度。

從圖1b可以看出,pH值對白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的影響比較大,弱酸性比弱堿性更有利于菌體的降解,當pH=5.6時,DMP降解效率最大。這可能是由于菌體對DMP的降解主要是依賴其分泌的酶活,當pH值高于或低于一定范圍時,將影響酶活,從而降低其對DMP的降解能力。因此后續實驗將pH=5.6作為反應條件。

由圖1c可知:當DMP初始質量濃度小于10 mg/L時,降解效率隨DMP質量濃度升高而升高;當DMP初始質量濃度為10 mg/L時,降解效率達到最大值,為75%;當DMP初始質量濃度大于10 mg/L時,降解效率迅速下降。因此,考慮到環境中實際的DMP質量濃度范圍和菌體降解特性,后續實驗將初始DMP質量濃度設為10 mg/L。

白腐真菌P.chrysosporium在上述最佳條件下對DMP的降解效率僅為75%,為了提升其降解效率,下面實驗嘗試優化其他參數,探究碳源質量濃度、H2O2質量濃度、Mn2+質量濃度對DMP生物降解的影響。

從圖1d可以看出,反應體系中的葡萄糖質量濃度對生物降解效率的影響較大,當葡萄糖質量濃度在5 g/L時,降解效率能達到95%,當其質量濃度為10、15、20 g/L時,降解效率逐漸下降。葡萄糖在體系中作為碳源被微生物利用,當其質量濃度有限時,DMP能很快充當碳源被微生物利用,這加速了污染物的消耗。此外,碳源的短缺可以極大地促進過氧化物酶的產生,而過氧化物酶在有機物的降解中扮演著重要的角色,這也可能是碳源受限的情況下DMP降解效率更高的原因。因此,后續實驗將葡萄糖質量濃度設為5 g/L。

有研究顯示,H2O2可以激活酶促反應[29]。從圖1e可以看出,在30 ℃、pH=5.6、DMP初始質量濃度為10 mg/L下,當體系中H2O2質量濃度為20 μg/L時,DMP被完全去除,此時的降解效率明顯高于其他實驗組。在僅加20 μg/L H2O2的對照組中,DMP的降解效率為27%,這說明體系中的H2O2并不是通過氧化反應來降解DMP,而是通過激活白腐真菌P.chrysosporium產生酶來降解DMP。當H2O2質量濃度為30 μg/L時,DMP降解效率下降極大,這說明高質量濃度的H2O2抑制酶的產生,不利于DMP降解。

從如圖1f可以看出,在30 ℃、pH=5.6、DMP初始質量濃度為10 mg/L下,當體系中Mn2+質量濃度為27.0 mg/L時,DMP降解效率最大,此時的降解效率為100%,而繼續增加Mn2+質量濃度,Mn2+的促進作用不明顯。

迄今為止,有很多研究者從廢水、活性污泥中分離到能夠降解DMP的細菌,這種方式耗時長且需要馴化。本次實驗表明,真菌,尤其是白腐真菌在DMP的降解中也可以大有作為。

綜上所述,溫度為30 ℃、pH=5.6、DMP初始質量濃度為10 mg/L是白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的最佳降解條件,反應7 d后降解效率達到75%,而此條件下空白對照和吸附對照的降解效率遠小于20%,這說明DMP的消失是由于生物的降解而不是吸附。進一步優化反應條件的結果如下:當體系中葡萄糖質量濃度為5 g/L時,降解效率能達到95%;當體系中加入20 μg/L H2O2或者27.0 mg/L Mn2+,都能使DMP降解效率顯著提升,達到100%。

2.2 酶促降解研究

幾乎所有的白腐真菌都能產生過氧化物酶——MnP酶和LiP酶,這2種過氧化物酶在白腐真菌降解污染物的過程中起著不可或缺的作用。白腐真菌P.chrysosporium暴露在10 mg/L DMP、27.0 mg/L Mn2+中,MnP酶活性隨暴露時間的變化如圖2所示。

在10 mg/L DMP的脅迫下,MnP酶活性在第1天達到第1個峰值6.11 U/L后,隨反應時間增加而增加,在第5天達到最大值8.79 U/L。在整個反應階段,DMP脅迫下的MnP酶活性均高于對照組。此現象表明,白腐真菌P.chrysosporium在DMP的脅迫下仍能保持較強的活性,其原因主要有以下2個方面:① 白腐真菌P.chrysosporium具有耐DMP的特性,通過分泌大量的MnP酶抵御DMP的侵害;② 隨著反應進行,碳源在不斷消耗,碳源的受限是白腐真菌P.chrysosporium分泌更多MnP酶的充分條件。而在白腐真菌P.chrysosporium、DMP、Mn2+共存的體系中,MnP酶活性在第5天達到最大值15.51 U/L,這可能是由于Mn2+作為MnP酶的反應底物,能極大地促進白腐真菌P.chrysosporium分泌MnP酶,并在生產MnP酶的過程中利用誘導基因轉錄調整整個反應過程中MnP酶的生產量,因此,MnP酶在有機物的降解過程中起著不可或缺的作用。MnP酶在Mn2+存在的條件下將Mn(Ⅱ) 氧化成Mn(Ⅲ),從而有效精準地還原底物。錳(Mn)在MnP酶的表達和污染物的降解中起調控作用,低質量濃度的必需重金屬物質對分解酶系統的作用是至關重要的。

白腐真菌P.chrysosporium暴露在10 mg/L DMP、27.0 mg/L Mn2+中,LiP酶活性隨暴露時間的變化如圖3所示。

圖3 LiP酶活性隨暴露時間的變化

在10 mg/L DMP的脅迫下,LiP酶活性在第6天達到最大值4.25 U/L。LiP酶是白腐真菌P.chrysosporium的次級代謝產物,僅在缺乏氮源的情況下被激活,隨著反應進行,氮源被不斷消耗,LiP酶活性逐漸增強。在整個反應階段(第6天除外),DMP脅迫下的LiP酶活性均低于對照組,這說明DMP抑制LiP酶活性。在白腐真菌P.chrysosporium、DMP和Mn2+共存的體系中,LiP酶活性低于對照組(第6天、第7天除外),這說明Mn2+對于LiP酶活性有抑制作用。

從圖2、圖3可以看出:在3種體系下,LiP酶活性的峰值遠小于MnP酶,這說明MnP酶在DMP降解中起著更重要的作用; MnP酶和LiP酶出現峰值的時間不一致,后者稍晚于前者,這可能是由于LiP酶的產生依賴于通過MnP酶氧化草酸生成過氧化氫。

2.3 降解機理研究

2.3.1 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜是利用物質在不同波數下吸收峰不同的性質,來鑒別官能團的種類,如O—H、C—N、C—O、C—N—C、P—O—C等化學鍵[30]。菌體在DMP環境下分別反應0、5 d后,其紅外光譜如圖4所示。

圖4 DMP降解前后P.chrysosporium菌的FTIR譜圖

從圖4可以看出:在3 338 cm-1附近吸收峰出現漂移,這表明存在羧基中的—OH伸縮振動;在2 933 cm-1附近出現吸收峰偏移,可能是由于真菌蛋白質上碳氫化合物中的非對稱與對稱亞甲基的伸展振動[31];吸收峰由1 658 cm-1移動到1 656 cm-1,表明菌體上—C=O 發生伸展振動;在1 300～900 cm-1內出現吸收峰漂移,表明有醇類和羧酸中的C—O伸縮、C—N 伸縮、P—O—C 伸縮、C—O—C 伸縮;在1 000～650 cm-1出現吸收峰漂移,表明有芳烴的C—H面外彎曲振動;吸收峰從3 353 cm-1偏移至3 338 cm-1,對應細胞壁結構中的P—S伸縮變動、—OH伸縮和蛋白質特有的C—N—C剪式振動,這表明羥基發生了多樣的變化,由多聚體變為單聚體甚至游離態。

圖4結果表明,在DMP生物降解過程中,白腐真菌P.chrysosporium中的羧基、羥基等官能團發揮著重要作用。

2.3.2 DMP降解途徑推測

根據LC-MS聯用儀檢測結果推測,DMP在白腐真菌P.chrysosporium作用下的降解路徑主要有3種,如圖5所示。

圖5 DMP可能的降解路徑

1) 側鏈縮合成環。在·OH自由基作用下,DMP的2條側鏈失去甲氧基,產生水楊酸[32]。

2) 苯環開環。DMP及其一些含苯環的中間產物在·OH 自由基作用下,發生開環,裂解成分子量較小的脂肪酸鏈,最終降解成無害化的CO2和H2O[33]。

3) 在DMP分子的側鏈上,一側C=O 鍵發生斷裂,在·OH自由基攻擊下,DMP裂解形成羥基化中間產物,隨著反應繼續,側鏈上的 C—O 鍵發生斷裂,鄰苯二甲酸單甲酯(monomethyl phthalate,MMP)形成,然后MMP經過環化形成鄰苯二甲酸酐,最終被降解為無害化的 CO2和H2O[34]。

3 結 論

本文探究不同條件下白腐真菌P.chrysosporium對DMP的最佳降解效果,實驗發現:

1) 白腐真菌P.chrysosporium降解DMP的最佳降解條件是溫度為30 ℃、pH=5.6、DMP初始質量濃度為10 mg/L,反應7 d后DMP降解效率達到75%。

2) 當體系中加入葡萄糖的質量濃度為5 mg/L時,DMP降解效率為95%;體系中加入20 μg/L H2O2或者27.0 mg/L Mn2+都能使DMP降解效率顯著提升,達到100%。

通過測定白腐真菌P.chrysosporium/DMP體系中的MnP酶和LiP酶,發現反應中LiP酶活性的峰值遠小于MnP酶,這說明MnP酶在DMP的降解中起著更重要的作用。

實驗利用LC-MS聯用儀鑒定DMP的降解產物,并討論3種可能的降解途徑,根據檢測到的中間產物推測,·OH攻擊 DMP 分子中C=O、C—C鍵等,經過羥基化、環化、開環等過程產生中間產物,隨著反應繼續,·OH 繼續氧化中間產物生成一些低分子物質,最終DMP被氧化成CO2和 H2O。