無機硒添加方式及NADPH或果糖添加對酵母富硒培養的影響

陳紫荊, 孫朝陽, 張玉英, 楊思林, 魏春廳, 羅建平

(1.合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.安徽省華信生物藥業股份有限公司,安徽 界首 236502)

硒(Se)是一種人體必需的微量元素,為機體維護免疫系統穩態、延緩衰老等生理功能所必需,缺硒不僅會誘發克山病、大骨節病的發生,而且增加心血管系統、內分泌系統、神經系統、生殖系統、運動系統等疾病發生的風險[1-3]。自然界中,硒分為無機硒和有機硒2種形式,由于無機硒生物利用度低且對人體毒性大,因此攝取富含硒蛋白、硒氨基酸等有機硒是人體補硒的主要途徑,目前富硒酵母是最易獲得、使用最為安全有效的人及動物的補硒來源[4-6]。

富硒酵母是酵母細胞在含有無機硒的培養基中經發酵培養所得。研究表明,酵母的富硒水平受限于發酵培養過程中酵母細胞將無機硒轉化為有機硒的能力,不僅與無機硒的添加方式有關,而且與無機硒由酵母細胞外進入胞內及胞內無機硒轉化為有機硒反應中輔助因子供應有關[7-9]。因此,在優化無機硒添加方式的同時促進無機硒有效進入胞內,提高酵母細胞轉化無機硒為有機硒的能力,可以有效地促進高富硒酵母的生產。

無機硒的添加方式以添加時間和添加濃度最為關鍵[7-9],還原型輔酶Ⅱ(NADPH)是酵母細胞中既直接參與無機硒轉化為有機硒反應的輔助因子,又是反應過程中產生的氧化產物的還原劑,果糖可促進無機硒由胞外進入胞內從而提高胞內有機硒生成反應底物濃度[10-11],鑒于此,本文以前期經誘變篩選出的酵母菌株HSX-02[12]為材料,將在無機硒添加時間和添加質量濃度優化的基礎上考察NADPH或果糖的添加對酵母富硒發酵培養的影響,以期為高富硒酵母的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株為啤酒酵母(中國工業微生物菌種保藏管理中心館藏號:1412)經NaN3誘變、H2O2篩選所得的富硒菌株HXS-02[12]。

化學試劑有:亞硒酸鈉、甲酸、濃氨水、甲苯、氫氧化鈉均購于國藥集團化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸、鹽酸羥胺均購于陽光生物科技有限公司;3,3′-二氨基聯苯胺均購于華中海威(北京)基因科技有限公司。

液體培養基由麥芽膏粉130 g/L和氯霉素0.1 g/L組成(廣東環凱微生物科技有限公司),使用時加入定量蒸餾水溶解、調節pH值至5.6±0.2,并經121 ℃滅菌20 min[13]。

1.2 儀器與設備

HQ45Z恒溫搖床(中國科學院(武漢)科學儀器廠);SKP-02電熱恒溫培養箱(湖北省黃石市醫療器械廠);DGF30/7-I電熱鼓風干燥箱(南京實驗儀器廠);V1100可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);TC-201恒溫水浴鍋(上海琪特分析儀器有限公司);CT15RT高速冷凍離心機(上海天美科學儀器有限公司);MDF-U73V SANYO超低溫冰箱、MLS-3750 SANYO高壓蒸汽滅菌鍋(日本Osaka公司);SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);XSZ-3G普通光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);AL 104分析天平(梅特勒-托利多公司);PHS-3E pH臺式酸度計(武漢天壹力儀器設備有限公司);LGJ-18S原位冷凍干燥機(北京松源華興科技發展公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母生長和富硒能力的變化

按照文獻[12]方法,挑取1環菌種于裝液量為50 mL液體培養基的搖瓶(250 mL)中,28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養24 h作為活化的菌種。取活化的菌種以10%的接種量轉移至新鮮的液體培養基中振蕩培養6 h,加入亞硒酸鈉至終質量濃度為25 mg/L,繼續培養48 h,期間每隔6 h離心收集菌體,測定菌株生物量和富硒能力的變化。

1.3.2 無機硒添加方式對酵母富硒能力的影響

1) 無機硒的添加時間。活化的菌種在搖瓶振蕩培養的0、2、4、6、8、10 h分別加入亞硒酸鈉至質量濃度為25 mg/L,繼續培養至24 h,測定無機硒添加時間對菌株生長和富硒能力的影響。

2) 無機硒的添加質量濃度。活化的菌種搖瓶振蕩培養8 h,分別加入亞硒酸鈉至質量濃度為12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 mg/L,繼續培養至24 h,測定無機硒添加質量濃度對菌株生長和富硒能力的影響。

3) 無機硒添加后酵母富硒能力的變化。活化的菌種搖瓶振蕩培養8 h時,加入亞硒酸鈉至質量濃度為62.5 mg/L,繼續培養,共培養至72 h,期間每隔8 h離心收集菌體,測定菌株生物量和富硒能力的變化。

4) NADPH對酵母富硒能力的影響。取活化的菌種,搖瓶振蕩培養8 h時,加入亞硒酸鈉至質量濃度為62.5 mg/L的同時分別加入NADPH至濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L,繼續培養,共培養至24 h,測定NADPH對菌株生長和富硒能力的影響。

5) 果糖對富鉻酵母富硒能力的影響。取活化的菌種,搖瓶振蕩培養8 h,加入終質量濃度為62.5 mg/L亞硒酸鈉的同時分別加入果糖至質量濃度為2、4、6、8、10 g/L,繼續培養至24 h,測定果糖對菌株生長和富硒能力的影響。

1.3.3 菌體生物量與富硒能力的測定

1) 菌體生物量。培養結束后,8 000 r/min,離心10 min收集菌體,經去離子水離心洗滌2～3次后,于60 ℃下烘干至恒重,測定菌體的質量濃度。

2) 富硒能力。烘干的菌體中總硒質量分數(w總硒)及產率(用ρ總硒表示)、有機硒質量分數(w有機硒)及產率(用ρ有機硒表示)、有機硒占比的測定按文獻[12]方法進行。

1.3.4 數據統計與分析

每個單獨實驗至少重復3次,所有實驗數據均以(平均值±標準差)表示,并利用SPASS 17.0軟件進行數據統計處理,采用ANOVA進行不同實驗組間的鄧肯氏差異分析(P<0.05),采用Origin 8.0軟件繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 菌種培養時間對酵母富硒能力的影響

菌種培養時間對酵母富硒能力的影響如圖1所示,圖1中,不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。由圖1可知:菌株HXS-02在搖瓶培養12～24 h內快速生長,ρ菌株在24 h時達到最高,為(3.52±0.15) g/L,且顯著高于其他時間點(P<0.05);菌體的w總硒隨著培養時間的增加而快速增加,在24 h后逐漸減緩,但ρ總硒隨時間的變化呈現先增加后降低的趨勢,且在24 h達到峰值,為(7 664.9±361.17) μg/L;相應地,菌體的w有機硒、ρ有機硒在24 h前也呈現快速增長的趨勢,隨后趨于穩定;期間有機硒占總硒的質量分數從12 h的89%上升到24 h后的97%。由以上分析可知,24 h為菌株無機硒添加方式優化時的最佳培養時間。

2.2 硒添加時間對酵母富硒能力的影響

無機硒的添加時間不僅影響酵母的生長,而且影響有機硒的積累[14]。亞硒酸鈉添加時間對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖2所示。由圖2可知,隨著亞硒酸鈉添加時間的延遲,酵母培養24 h后菌株的質量濃度逐漸增加,w總硒、w有機硒在添加時間為6 h達到最高,ρ總硒、ρ有機硒在添加時間為8 h時達到最高,有機硒占總硒質量分數在添加時間為6 h時超過95%,隨后穩定。酵母富硒發酵既要使收獲的菌體有機硒質量濃度高,也要使收獲的富硒酵母產率高,雖然亞硒酸鈉在培養6 h時添加比在培養8 h時添加所收獲的菌體有機硒質量濃度高,但ρ有機硒只有8 h的87%,因此選擇搖瓶培養8 h為亞硒酸鈉的最適添加時間。

圖2 硒添加時間對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

2.3 硒添加質量濃度對酵母富硒能力的影響

培養基中的無機硒質量濃度會影響酵母對硒的轉化吸收和酵母生物量的積累,當培養基中無機硒的質量濃度過高時,酵母的生物量和有機硒轉化率會受到抑制[14]。因此適宜的無機硒質量濃度是酵母富硒的重要條件。亞硒酸鈉添加質量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖3所示。

圖3 亞硒酸鈉質量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖3可知,隨著ρ亞硒酸鈉的增加,富硒酵母的ρ菌株逐漸下降,w總硒、w有機硒和有機硒占比逐漸上升至亞硒酸鈉質量濃度為62.5 mg/L時達到最高,其中w總硒、w有機硒均比亞硒酸鈉質量濃度為25.0 mg/L時的值高30%以上,而ρ總硒、ρ有機硒在亞硒酸鈉質量濃度為25.0 mg/L時分別達到(8 099.7±430.9)、(7 869.7±412.7) μg/L,隨后下降,至亞硒酸鈉質量濃度為62.5 mg/L時重新達到峰值。考慮到菌體在亞硒酸鈉質量濃度為25.0 mg/L時的w總硒,特別是w有機硒低于亞硒酸鈉質量濃度為6.25 mg/L時的值,且有利于后續有機硒產率的優化提高,因此選擇62.5 mg/L為亞硒酸鈉的最適添加質量濃度。

2.4 發酵時間對酵母富硒能力的影響

以培養時間8 h時加入質量濃度為62.5 mg/L的亞硒酸鈉作為優化的無機硒添加方式,考察酵母生長和富硒能力在培養過程中的變化,結果如圖4所示。

圖4 硒添加方式優化后對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖4可知:ρ菌株在亞硒酸鈉添加后呈先上升后降低的趨勢,培養24 h達到生長峰值;w總硒、w有機硒隨培養時間的延長而增加,在培養的48 h均達到峰值,隨后迅速下降,有機硒占總硒的質量分數在培養24 h后均維持在97%以上,雖然ρ總硒、ρ有機硒也呈先上升后降低的趨勢,但兩者的峰值均出現在培養的24 h,約是培養48 h的1.3倍。綜合以上結果,以ρ總硒、ρ有機硒計,酵母菌株HXS-02富硒培養時加入亞硒酸鈉的適宜時間和適宜質量濃度分別為8 h和62.5 mg/L,適宜的富硒發酵時間為24 h。

2.5 NADPH或果糖的添加對富硒能力的影響

NADPH的濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖5所示。

圖5 NADPH濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖5可知,NADPH的添加可以顯著影響菌株的生長,隨著NADPH添加濃度的提高,菌株的生長干重呈現先增加后降低的趨勢,當cNADPH在0.15～0.20 mmol/L時,w菌株最高,比未添加NADPH菌株的質量分數高23%以上;w總硒、w有機硒以及ρ總硒、ρ有機硒也隨NADPH添加濃度的增加呈現先增加后減緩的趨勢,并均在cNADPH為0.20 mmol/L時達到峰值,有機硒占總硒的質量分數均保持在97%以上。結果表明,在無機硒添加的同時,在培養基中加入適量的NADPH不僅有效促進菌株的生長,而且可明顯提高酵母細胞轉化無機硒為有機硒的能力,與未添加NADPH的培養相比,0.20 mmol/L NADPH的添加可使菌株的w總硒、ρ總硒、w有機硒、ρ有機硒分別提高15.8%、42.6%、16.1%、42.9%。

果糖的質量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖6所示。

圖6 果糖質量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖6可知,果糖的添加可顯著促進菌株的生長,促進作用隨果糖質量濃度增加至6 g/L時呈現快速上升趨勢,繼續增加ρ果糖則促進作用開始下降,與未添加果糖的培養相比,添加6 g/L的果糖可使ρ菌株提高32.6%;果糖添加后菌株的總硒及有機硒的質量濃度和產率表現出與菌株生長相似的變化趨勢,當培養基中果糖添加至質量濃度為6 g/L時,它們的值均達到最高;與未添加果糖的培養相比,果糖的添加不改變菌株中有機硒占總硒的質量分數,添加6 g/L的果糖雖然僅使w總硒從(2 851.9±69.3) μg/g提高到(2 969.2±15.0) μg/g、w有機硒從(2 789.5±67.7) μg/g提高到(2 903.0±15.7) μg/g,但可使ρ菌株、ρ總硒、ρ有機硒分別提高32.6%、38.1%、38.0%。結果表明,果糖的添加可通過促進酵母細胞生物量的增加,從而提高富硒酵母的產率。

3 結 論

本文以前期篩選出的釀酒酵母菌株HXS-02為起始菌株,以有機硒的轉化能力為指標,經酵母富硒培養過程中無機硒添加時間和添加質量濃度的優化,確定了無機硒的最佳添加方式為菌株搖瓶培養8 h時添加ρ亞硒酸鈉為62.5 mg/L。在此添加方式下菌株經24 h培養后總硒和有機硒的產率最高,分別比優化前提高了14.3%、15.8%。

NADPH作為細胞代謝的一種還原力,果糖作為細胞代謝的一種能量物質,在亞硒酸鈉添加的同時,適當添加NADPH或果糖可進一步提高菌株的富集有機硒能力,其中NADPH可通過促進菌株生長和轉化無機硒為有機硒能力實現有機硒的高水平富集,而果糖則是通過促進菌株的生長實現有機硒的高水平富集。結果表明,酵母在富硒培養過程中采取適合的無機硒添加方式并輔以添加適量的NADPH或果糖,將可有效地提高酵母富硒培養的產率。NADPH和果糖是否對酵母富硒培養具有協同作用尚有待研究。