白介素6在甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠治療大鼠牙周炎中的變化

陳東 王立津

與牙周炎癥關系密切的主要細胞因子中,白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)參與并促進了牙周組織特別是牙槽骨的一系列破壞活動。有研究發現,IL-6不僅可以通過作用破骨細胞前體刺激破骨細胞的形成,還可以通過刺激成骨細胞系表達RANKL,進而促進破骨細胞生成,其中相關機制為IL-6通過激活Janus 激酶 2(janus kinase 2,JAK2)和人核因子KB受體活化因子配體(human nuclear factor KB receptor activator ligand,RANKL)信號通路來介導并增加破骨細胞分化[1]。臨床調查發現,唾液中的IL-6水平與C-反應蛋白、牙齒數量、臨床附著喪失(CAL)、牙周袋深度(PPD)和出血部位(FMB)呈負相關;而牙周炎患者的唾液IL-6水平與口腔牙齒數量呈負相關,直接與牙周炎的患病范圍呈正比例相關[2]。動物實驗發現,阻斷IL-6受體(IL-6R)就可以抑制減少IL-6介導的促炎活性導致的牙槽骨吸收和附著喪失[3]。國外報道殼聚糖阿托伐他汀凝膠在體外細胞模型研究中可以降低IL-6的表達水平[4],在大鼠牙周炎模型的結果與體外細胞模型結果一致[5]。國內也開展過羧甲基殼聚糖與IL-6表達的體外細胞模型研究[6]。作者前期開展了有關甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel,M/CMCS)對大鼠牙周炎模型破骨細胞和前列腺素E2影響的研究,發現試藥能夠減輕大鼠牙周炎癥、減少骨吸收、促進愈合[7]。本研究考察M/CMCS治療大鼠牙周炎模型過程中IL-6的相關表達變化情況。依照本文作者的前次相關研究方法[7,8],適當予以改進。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材 麻醉劑2%戊巴比妥鈉;Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)(上海碧云天生物技術有限公司);大鼠IL-6 ELISA試劑盒和IL-6免疫組化檢測試劑盒(均為武漢愛博泰克生物科技有限公司產品)。

1.2 試驗藥物 參照本實驗室前次辦法,自制甲硝唑羧甲基殼聚糖復方溫敏凝(含0.75%甲硝唑和20%羧甲基殼聚糖)[8];0.75%甲硝唑凝膠(湖北康正藥業有限公司)和2%鹽酸米諾環素軟膏(日本Sunstar株式會社,商品名:PERIO?,均商業采購。

1.3 動物建模與分組 動物模型建立參照本組前次方法進行[7,8]。SPF級75只,8周齡,體重(275±25)g,健康雄性SD大鼠,購自華北理工大學醫學動物實驗中心。動物常規適應性飼養1周,在2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后,在大鼠雙側上頜第一磨牙齦緣處腭側打結結扎結扎絲,然后1次/d,連續3次密度為1×109CFU/ml的200 μl的牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)牙周接種,給與10%葡萄糖飲水。造模后每周檢查1次,第6周結束前檢查牙周情況,并隨機抽取3只大鼠施行安樂死,X線片和HE病理學檢查評估。模型成功判定參照文獻與作者過去的造模標準[9,10]。結果顯示模型全部成功。然后將剩下72只大鼠隨機分為4大組,每組18只。MODEL組:陽性模型對照組,上頜第一磨牙齦緣處和牙周袋不涂布任何藥物;M/CMCS組:涂布自制的甲硝唑羧甲基殼聚糖溫敏凝膠;PERIO組:涂布2%鹽酸米諾環素軟膏;MNZ組:涂布0.75%甲硝唑凝膠。局部早晚各涂藥1次,持續至各組動物在相應時間點,即涂藥開始后滿1周(第8天),滿3周(第22天)和滿5周(第36天),各組分別隨機抽取6只大鼠,麻醉狀態下采集全血,然后實施安樂死,分離截取上頜骨。一側上頜骨組織塊供ELISA實驗,后續處理方法見1.4.3;對側上頜骨供免疫組化實驗,具體方法見1.5 的IL-6免疫組織化學實驗部分。

1.4 ELISA法檢測組織樣本的IL-6濃度

1.4.1 齦溝液測試樣本制備:在治療開始期滿的第1、3、5周計劃時間點,依既往辦法采集每組抽取的6只大鼠齦溝液[7]。

1.4.2 全血測試樣品制備:各時間點、每組采集齦溝液結束后的6只大鼠,麻醉狀態下無菌切開腹腔,在脊柱下段旁側用負壓抗凝管穿刺采取腹主動脈血5 ml,低溫離心5 min,取上清液放-80℃冰箱凍存、待測。

1.4.3 上頜骨牙周軟、硬組織取材與標本制備:全血采集后,脊椎脫臼法處死大鼠,剝離完整上頜骨及附帶牙周軟組織,上頜骨截斷左右2段,分為2組。一側頜骨放入4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液中固定,制作石蠟切片供IL-6免疫組織化學實驗。另一側頜骨,在拔牙后分離牙槽窩周邊厚約2 mm范圍軟組織(每樣本≥50 mg),置無菌凍存管液氮冷凍;牙槽骨每樣本≥30 mg標記后也立即液氮冷凍,供裂解蛋白提取。

1.4.4 牙周組織與牙槽骨總蛋白提取:分別取出稱重的軟組織和牙槽骨凍存管,置液氮缽中2 min內快速加液氮、磨成細粉末。粉末入離心管后按照20 mg組織配200 μl的比例加入Western及IP細胞裂解液混勻,冰浴、低溫離心得上清液,轉移上清液即分別得到牙周和骨組織總蛋白提取物,分裝標記后-80℃冰箱保存。

1.4.5 ELISA法分析IL-6濃度:分別取前述制備凍存的大鼠齦溝液、全血、牙周組織與牙槽骨總蛋白提取上清液標本,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測標本中IL-6的含量。嚴格遵照ELISA試劑盒說明書操作,終止反應后以酶標儀450 nm波長處空白對照孔調零后,測各孔OD值,標準曲線求方程式,計算濃度。

1.5 免疫組化實驗檢測IL-6表達 前述1.3處固定的頜骨組織塊,常規脫鈣脫水包埋制作石蠟塊,沿上頜骨長軸作矢狀連續5 μm切片,取最佳取材位點基本相同位置制備切片備用。按照大鼠白介素IL-6免疫組化檢測試劑盒說明書操作。脫水后封片。先用4 X光鏡觀察,然后換400 X采集圖像進行定量分析,每張切片中各選取5個面積相同的視野拍攝圖片Image-Pro Plus6.0圖像分析系統處理,計算平均光密度值(mean optical density,MOD)。

2 結果

2.1 4種不同樣本的IL-6濃度比較

2.1.1 齦溝液:MODEL組在第1、3、5周3時間點的IL-6濃度變化不大(P>0.05),藥物干預后,則M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1周、第3周和第5周較MODEL組同期均明顯下降(P<0.05);3治療組間比較,M/CMCS組和PERIO組的IL-6濃度值在第1、3、5周時間點均分別比MNZ組同期的濃度值低(P<0.05),在第5周時間點,M/CMCS組IL-6濃度值比PERIO組低(P<0.05)。見表1。

表1 不同藥物對大鼠齦溝液中IL-6影響 n=6,pg/mL,

2.1.2 牙周軟組織:M/CMCS組、PERIO組和MNZ組各組內的IL-6濃度值,在各組組內第3周和第5周分別較第1周明顯降低(P<0.05);與MODEL組IL-6濃度比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在3個時間點均降低(P<0.05);M/CMCS組與PERIO組在第3周和第5周均較同期MNZ組為低(P<0.05);M/CMCS組在第5周時低于PERIO組(P<0.05)。見表2。

表2 不同藥物對大鼠牙周軟組織組織中IL-6的影響 n=6,pg/ml,

2.1.3 牙槽骨:與MODEL組比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1、3、5周各時間點的IL-6濃度均降低(P<0.05)。M/CMCS組與PERIO組的IL-6濃度值在第1周、第3周和第5周,均分別較MNZ組低(P<0.05)。見表3。

表3 不同藥物對大鼠牙槽骨中IL-6的影響 n=6,pg/ml,

2.1.4 全血血清:M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1、3、5周時間點分別較MODEL組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),但M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在相同時間點的組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同藥物對大鼠全血中IL-6的影響 n=6,,pg/ml

2.2 4組內不同組織樣本的IL-6濃度比較 M/CMCS組、PERIO組和MNZ組,齡溝液、牙周軟組織和牙槽骨的IL-6濃度在第3、5周時,均低于第1周(P<0.05);PERIO組牙周組織在第3周和第5周時均高于牙槽骨(P<0.05),MNZ組第3周時牙周組織的值高于牙槽骨(P<0.05)。見表5。

表5 4組不同樣本組織的IL-6濃度結果比較 n=6,pg/ml,

2.3 牙周組織IL-6的免疫組織化學結果 在實驗結束時間點,MODEL組牙周組織毀損嚴重,齦乳頭潰爛且牙周袋異常明顯,附著嚴重喪失,牙槽骨水平型吸收至根尖;M/CMCS組可見牙齦乳頭形態較完整且染色明顯局限在上皮組織,牙周袋淺且遠中健康牙一側牙周袋較結扎側明顯淺,且結合上皮未見明顯向根部方向退宿,齦牙結合點較對側少許降低但不明顯,齦乳頭下的牙齦纖維致密有序,未見明顯牙槽骨吸收;PERIO組牙周軟組織輕度損傷,但牙槽骨水平型吸收較M/CMCS組嚴重;MNZ組齦乳頭形態受損,齦乳頭消失,齦乳頭下的牙齦纖維少許紊亂水腫,結合上皮附著向根部部分退縮,牙槽骨水平伴垂直線吸收、面積大且深,染色較深。見圖1。

圖1 第5周試驗結束時大鼠牙周組織IL-6的免疫組織化學染色(n=6);淺黃色、棕黃色表示陽性細胞的染色強度;B:牙槽骨;P:牙周膜;R:牙根

2.4 不同藥物對大鼠牙周組織的IL-6免疫組化MOD值的影響 MODEL組IL-6一直處于較高的水平且未隨時間產生明顯變化;與MOPEL組各相同時間點比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組分別在第1、3、5周下降明顯(P<0.05),但MNZ組的值又明顯高于其他2組(P<0.05);在第5周時,M/CMCS組的值也低于PERIO組(P<0.05)。見表6。

表6 不同時間點牙周組織IL-6表達水平(MOD值) n=6,

3 討論

現在普遍認為IL-6是破骨細胞骨吸收的促進劑,在慢性和急性炎癥包括牙周炎的過程中參與骨丟失的發病機制[10,11]。此外,IL-6中和抗體抑制TNF-α和IL-1β刺激的破骨細胞形成[12]。在牙周炎發生發展過程中,IL-6與牙槽骨的代謝關系密切,也是破骨細胞分化和骨吸收的有效刺激因子。IL-6可刺激基質細胞產生破骨細胞生成因子RANKL,RANKL表達水平上調即會導致牙槽骨丟失[13]。牙周炎等一些炎癥性疾病過程中,IL-6水平升高[14],且與牙周炎的持續性牙周組織破壞相關,IL-6表達強度與附著喪失呈正相關。

本實驗的MODEL組,大鼠上頜骨牙周組織受損嚴重,牙槽骨呈現水平型吸收幾乎直達根尖部位,而IL-6在齦溝液、牙周軟組織和牙槽骨的濃度,并沒有隨著時間的推移而下降。表現為穩定的表達值。但是,結果藥物干預后,IL-6的濃度值在牙周局部組織立即出現了明顯下降。免疫組化結果顯示,藥物治療后牙周組織的IL-6表達明顯受到抑制;形態學方面,牙齦和牙周膜纖維的損傷,特別是牙槽骨吸收,藥物干預均有不同程度的改善,顯示3種藥物局部治療均有效,其中MNZ組表現稍差,而M/CMCS組則優勢明顯。

本動物模型試驗發現齦溝液的IL-6表達水平較全血為高,但是比牙周組織為低,也存在第3周以后變化不明顯的情況,在未經藥物干預的MODEL組,齦溝液的IL-6表達水平一直穩定且較高。藥物干預后,同樣的,MNZ組的IL-6表達水平與其他2組藥物間存在統計學差異,而M/CMCS組的結果最優。

甲殼素作為牙周治療的局部藥物載體的研究越來越多,殼聚糖基生物支架能夠其可以加速新骨再生,促進組織新生血管的形成[15]。采用不同類型的殼聚糖(堿溶性和水溶性)制備殼聚糖阿托伐他汀凝膠,體外研究制劑的抗炎作用,利用TNF-α誘導的人牙齦成纖維細胞(hGF)模型作為實驗對象,培養hGF細胞時加入殼聚糖阿托伐他汀凝膠后,測定促炎(IL-1β、IL-6、IL-8)和抗炎(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-10)細胞因子的釋放,結果發現多種細胞因子包括IL-6的水平降低,殼聚糖的抗炎作用增強[4]。在大鼠牙周炎模型,同樣的殼聚糖制劑采用相同的細胞因子指標進行檢測分析,其結果與細胞模型較為一致[5]。國內也開展過相似的體外細胞模型研究,發現不同濃度的羧甲基殼聚糖能夠下調同一濃度脂多糖(LPS)誘導的人牙周膜成纖維細胞(HPDLFs)表達的IL-6,隨著羧甲基殼聚糖濃度增加,IL-6表達量呈逐漸減弱趨勢[6]。

總之, 通過本次三種不同藥物影響牙周炎模型大鼠的IL-6實驗結果,在齦溝液、牙周軟組織和牙槽骨,藥物干預后均出現了IL-6表達水平均減少的現象,且牙周組織病理形態較模型對照組均有不同程度的改善,其中,M/CMCS凝膠表現出一定的優勢,說明甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠有一定的抑制牙周炎癥時相關組織分泌IL-6的作用,進而發揮出保護牙周組織、減緩牙槽骨吸收的作用。