連翹酯苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

詹和道，姚江凌，崔紅旺

〔摘要〕 目的 探討連翹酯苷A對白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）誘導的軟骨細胞損傷的影響及其可能的作用機制。方法 采用50 mg/L IL-1β誘導人關節軟骨細胞建立細胞損傷模型，記為模型組；另取未處理細胞為對照組。采用1.25、2.5、5.0 μmol/L不同濃度的連翹酯苷A處理軟骨細胞，依次記為連翹酯苷A低、中、高劑量組。ELISA法檢測炎癥因子[IL-1β、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）]水平；采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，qRT-PCR檢測circSERPINE2表達量。pcDNA、pcDNA-circSERPINE2轉染至軟骨細胞后用IL-1β處理，si-NC、si-circSERPINE2分別轉染至軟骨細胞后用連翹酯苷A與IL-1β共同處理24 h，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量。結果 連翹酯苷A作用于IL-1β誘導的軟骨細胞后，炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白、circSERPINE2表達水平升高（P＜0.05）；轉染pcDNA-circSERPINE2后炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達水平及細胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05）；轉染si-circSERPINE2后，炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。結論 連翹酯苷A可通過上調circSERPINE2表達而抑制細胞炎癥因子表達及細胞凋亡，從而減輕IL-1β誘導的關節軟骨細胞損傷。

〔關鍵詞〕 連翹酯苷A；circSERPINE2；白細胞介素-1β；人關節軟骨細胞；炎癥；細胞凋亡；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.009

Effects of forsythoside A on IL-1β-induced chondrocyte injury

ZHAN Hedao， YAO Jiangling， CUI Hongwang*

The First Hospital of Hainan Medical College， Haikou， Hainan 570102， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of forsythoside A on IL-1β-induced chondrocyte injury and its possible mechanism of action. Methods Cell injury models of Human articular chondrocytes were established using 50 mg/L interleukin-1β （IL-1β）， which were denoted as model group. The untreated chondrocytes were taken as control group. Chondrocytes treated with 1.25， 2.5 and 5.0 μmol/L forsythoside A were recorded as low-， medium- and high-dose forsythoside A groups， respectively. The levels of inflammatory factors [IL-1β， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）] were measured by ELISA; the apoptosis rate was determined by flow cytometry; the expression of circSERPINE2 was measured by qRT-PCR. The pcDNA and pcDNA-circSERPINE2 were separately transfected into chondrocytes which were treated with IL-1β for 24 h afterwards; the si-NC and si-circSERPINE2 were separately transfected into chondrocytes which were co-treated with forsythoside A and IL-1β for 24 h afterwards. Then， the levels of IL-1β， IL-6， and TNF-α were determined by ELISA; the apoptosis rate was measured by flow cytometry; the protein expression levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blot. Results After forsythoside A acting on IL-1β-induced chondrocytes， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate， and Bax protein level decreased （P<0.05）， while the expression levels of Bcl-2 protein and circSERPINE2 increased （P<0.05）. After transfection of pcDNA-circSERPINE2， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate and Bax protein level decreased （P<0.05）， while Bcl-2 protein level increased （P<0.05）. After transfection of si-circSERPINE2， the levels of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， and TNF-α）， apoptosis rate and Bax protein level increased （P<0.05）， while Bcl-2 protein level decreased （P<0.05）. Conclusion Forsythoside A could reduce IL-1β-induced chondrocyte injury by up-regulating circSERPINE2 expression and thus inhibiting the expressions of cellular inflammatory factors and apoptosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 forsythoside A; circSERPINE2; interleukin-1β; human articular chondrocytes; inflammation; apoptosis; Bax protein; Bcl-2 protein

骨關節炎是常見的一種骨關節疾病，常發生于中老年人群中，關節軟骨細胞凋亡是造成細胞損傷的重要原因[1-2]。目前，尚缺乏有效治療骨關節炎的方法。研究表明，中醫藥及其活性成分可通過抑制軟骨細胞凋亡從而達到治療骨關節炎的目的[3-4]。連翹屬于我國傳統中藥，被廣泛用于治療炎癥、發熱等疾病。連翹酯苷A是從連翹中分離出的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用，可抑制由巨噬細胞活化引起的炎癥及氧化性疾病[5]。然而，連翹酯苷A對骨關節炎的治療效果及其可能的作用機制尚未可知。失調的環狀RNA（circRNA）與骨關節炎的發展有關[6]。據報道，circRNA絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員2（circSERPINE2）在骨關節炎中表達下調，其過表達可減弱白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）引起的軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解，是骨關節炎治療的新靶點[7-8]。本研究通過IL-1β誘導建立人關節軟骨細胞損傷模型，探討連翹酯苷A是否可通過調控circSERPINE2表達影響IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

1 材料與方法

1.1? 主要藥物、試劑及儀器

連翹酯苷A（上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：20191201，純度≥98%）；人關節軟骨細胞（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：20191006）；IL-1β（美國Sigma公司，批號：20190819）；DMEM培養液（上海碧云天公司，批號：20200225）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：20200114）；Trizol試劑、LipofectamineTM 3000轉染試劑（美國Invitrogen公司，批號：20190907、20190903）；反轉錄和熒光定量PCR試劑盒（美國Thermo Fisher公司，批號：20191106）；pcDNA、pcDNA-circSERPINE2、si-NC、si-circSERPINE2（上海吉瑪制藥技術有限公司，批號：20190828、20190817、20200108、20200112）；IL-1β、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）檢測試劑盒（美國Abcam公司，批號：20190206、20200324、20190907）；細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶公司，批號：20190706）。流式細胞儀（美國BD公司，型號：FACS-Calibur）；高速離心機（賽默飛世爾科技公司，型號：Micro17R）；PCR儀（美國ABI公司，型號：HT9700）。

1.2? 方法

1.2.1? 分組及處理? 于6孔板（1×104個/孔）接種軟骨細胞，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h[9]，記為模型組，未處理細胞作為對照組。用含1.25、2.5、5.0 μmol/L連翹酯苷A[10]與50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h，依次記為連翹酯苷A低劑量組、連翹酯苷A中劑量組、連翹酯苷A高劑量組。

1.2.2? 細胞轉染? 于6孔板（1×104個/孔）接種軟骨細胞，培養24 h，待細胞融合至80%時，參照轉染試劑操作說明書分別將pcDNA、pcDNA-circSERPINE2、si-NC、si-circSERPINE2轉染至軟骨細胞，實驗分為IL-1β+pcDNA組（轉染pcDNA后，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h）、IL-1β+pcDNA-circSERPINE2組（轉染pcDNA-circSERPINE2后，用含50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h）、IL-1β+連翹酯苷A+si-NC組（轉染si-NC后，用含5.0 μmol/L連翹酯苷A與50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h）、IL-1β+連翹酯苷A+si-circSERPINE2組（轉染si-circSERPINE2后，用含5.0 μmol/L連翹酯苷A與50 mg/L IL-1β的DMEM培養基培養24 h）。轉染后收集各組細胞行后續實驗。

1.3? 觀察指標

1.3.1? ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的水平? 將各組細胞培養上清液離心（350×g、10 min），取上清液，利用IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。嚴格根據試劑盒說明書進行實驗，各組細胞離心后取上清液行后續檢測，按照倍比稀釋制作標準品。將各組細胞上清液加入96孔板，分別加入樣品及標準品后洗板，加入生物素化抗體100 μL/孔，室溫下孵育60 min，洗板5次后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素100 μL/孔，孵育20 min后洗板5次，加入顯色劑TMB溶液100 μL/孔孵育20 min，加入終止液50 μL/孔后檢測450 nm處的吸光度（A）值，通過標準品曲線計算濃度。

1.3.2? 流式細胞術檢測細胞凋亡? 收集各組細胞并懸浮在1×結合緩沖液中，然后加入5 μL的AnnexinV-FITC溶液和10 μL PI（1 g/mL），在室溫和黑暗條件下對細胞進行15 min染色。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡的比例，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率（%）=早期細胞的凋亡比例+晚期細胞的凋亡比例。

1.3.3? Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量

提取各組細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度后，將總蛋白（30 μg）通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜分別與Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 000）在4 ℃下孵育12 h，洗膜，再與辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1∶3 000）在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發光試劑顯影，曝光，Tanon600圖像分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白的相對表達量。

1.3.4? qRT-PCR法檢測circSERPINE2的表達水平

取Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，反轉錄為cDNA，隨后，將該cDNA與SYBR Green和特異性引物一起在qRT-PCR儀上進行PCR擴增。反應系統（20 μL）：10 μL SYBR■ Premix Ex TaqTM（2×）、0.8 μL PCR正向引物（10 μmol/L）、0.8 μL PCR反向引物（10 μmol/L）、2 μL cDNA（200 ng/μL）和6.4 μL無菌水。PCR反應條件如下：95 ℃，30 s（預變性）；95 ℃，5 s（變性），55 ℃，10 s（退火），72 ℃，15 s（延伸），共計40個循環。GAPDH為circSERPINE2的內參基因，采用2-ΔΔCt法分析circSERPINE2相對GAPDH的表達水平。引物序列如下：circSERPINE2，正向5'-CGGGAAATCCTATCAAGTGC-3'，反向5'-ATTGAAGTGGGAGCAGATGG-3'；GAPDH，正向5'-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3'，反向5'-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3'。

1.4? 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，各檢測指標均為計量資料，以“ｘ±s”表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間比較采用SNK檢驗；兩組間均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 連翹酯苷A抑制IL-1β誘導的軟骨細胞中炎癥因子表達

與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平隨劑量升高而降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2? 連翹酯苷A抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡

與對照組比較，模型組細胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組細胞凋亡率、Bax蛋白水平隨劑量升高而降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平隨劑量升高而升高（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3? 連翹酯苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞中circSERPINE2表達的影響

與對照組比較，模型組circSERPINE2表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A低、中、高劑量組circSERPINE2的表達量升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4? 轉染后circSERPINE2表達比較

與pcDNA組比較，pcDNA-circSERPINE2組circSERPINE2表達量升高（P＜0.05）；與si-NC組比較，si-circSERPINE2組circSERPINE2表達量降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.5? circSERPINE2對IL-1β誘導的軟骨細胞中炎癥因子表達及細胞凋亡的影響

與IL-1β+pcDNA組比較，IL-1β+pcDNA-circSERPINE2組炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見圖2、表5。

2.6? 抑制circSERPINE2對軟骨細胞中炎癥因子表達及細胞凋亡的影響

與IL-1β+連翹酯苷A+si-NC組比較，IL-1β+連翹酯苷A+si-circSERPINE2組炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。詳見表6、圖3。

3 討論

IL-1β屬于促炎細胞因子，可誘導軟骨細胞產生過度炎癥反應，甚至凋亡，促進骨關節炎的發生和發展，被廣泛應用于骨關節炎的病理生理學研究[11-12]。骨關節炎屬中醫學“痹病”范疇，與“痹病”中“鶴膝風”“骨痹”“筋痹”相類似。膝關節骨性關節炎的發病與肝、脾、腎虧虛，風、寒、濕及瘀血客于局部有關，最終都導致局部血瘀氣滯、經絡痹阻不通而發病。研究表明，中醫藥及其活性成分具有抗骨關節炎作用[13]。circRNA可充當miRNA的海綿分子調節軟骨細胞增殖及凋亡，進而參與骨關節炎發生及發展過程[14]。但circRNA是否可作為中醫藥治療骨關節炎的潛在靶點尚未闡明。

連翹是一種傳統中藥材，由于其抗氧化、抗菌和抗病毒活性，在治療發熱、炎癥和潰瘍等疾病方面發揮著重要作用[15]。連翹酯苷A是從連翹中提取的主要生物活性成分，具有多種生物學特性，尤其是抗炎特性[16]。據報道，連翹酯苷A可抑制高葡萄糖誘導的足細胞氧化應激和炎癥損傷[17]。在脂多糖誘導的急性肺損傷中，連翹酯苷A可通過上調miR-124表達，抑制TNF-α和IL-6的產生，在體外和體內減輕脂多糖誘導的炎癥反應，進而減輕肺損傷[18]。本研究結果顯示，IL-1β處理可促進軟骨細胞炎癥反應的發生和軟骨細胞凋亡的增加，與既往研究報道結果相似[19-20]。給予連翹酯苷A干預后，隨著濃度的升高，IL-1β誘導的軟骨細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低，同時細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2表達水平升高，提示連翹酯苷A可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。

circSERPINE2源自SERPINE2基因，已被證實是骨關節炎中的保護性circRNA[6-7]。本研究檢測了IL-1β處理的軟骨細胞中circSERPINE2的表達，發現circSERPINE2表達水平降低，circSERPINE2過表達可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡，表明circSERPINE2的減少可能與IL-1β誘導的軟骨細胞損傷有關。給予連翹酯苷A處理后，IL-1β誘導的軟骨細胞中circSERPINE2的表達量升高，提示連翹酯苷A可能通過上調circSERPINE2表達而減輕IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。為進一步驗證circSERPINE2是否介導連翹酯苷A的抗骨關節炎作用，本研究在IL-1β誘導的軟骨細胞中敲低circSERPINE2，進行功能回復實驗。結果顯示，抑制circSERPINE2表達可拮抗連翹酯苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的作用。

綜上所述，連翹酯苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥因子表達及細胞凋亡具有抑制作用，這可能與其上調circSERPINE2表達有關。本研究表明，連翹酯苷A具有治療骨關節炎的潛在價值，但連翹酯苷A作用的circSERPINE2下游調控通路尚需進一步探究。

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（本文編輯? 周? 旦）