TCF7L2 基因多態性與妊娠期糖尿病相關性及影響因素的研究

吳玲，曾秋霞，馮銀仲，鄧綺娜，黎箐

江門市婦幼保健院產科，廣東江門 529000

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）指在妊娠期首次發生或發現的糖代謝異常，其主要的特征是葡萄糖耐受不良，是妊娠期最常見的代謝紊亂性疾病[1]。妊娠期高血糖近年來發生率逐年升高[2-4]，可導致系列不良臨床結局，如死產、妊娠期高血壓、產后出血、羊水過多、胎兒窘迫、早產、巨大兒等[5-7]，增加產后婦女患2 型糖尿病和肥胖癥風險[8]。遺傳因素是導致2 型糖尿病發生發展的關鍵因素，超過20 種遺傳變異與糖尿病和其他代謝標志物有關，尤其是TCF7L2 基因的多態性rs7903146[1]。

GDM 發病機制尚不完全清楚，胰島素抵抗和胰腺β 細胞異常是主要因素。目前的研究顯示其發病相關風險因素包括妊娠史、年齡、較高的體質指數、糖尿病家族史等。多數遺傳學研究都集中在與2 型糖尿病相關的變異體上，在與易感性相關的遺傳多態性中具有一定相似性，如MTNR1B，TCF7L2和CDKAL1 等遺傳多態性[9]。這些多態性和GDM風險之間的聯系尚存爭議，取決于診斷標準、基因型方法和病例對照研究的人群特征[10]，因此，需在臨床實踐中開展進一步的驗證性研究。本研究選取2021 年3 月—2022 年5 月江門市婦幼保健院接收的378 例孕婦作為研究對象，其中GDM 孕婦90例，產檢健康孕婦288 例。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院產檢的378 例孕婦作為研究對象。招募時獲得了所有參與者的書面同意。本研究經江門市婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準

根據中華醫學會婦產科學分會產科學組、中華醫學會圍產醫學分會、中國婦幼保健協會妊娠合并糖尿病專業委員會共同制訂的《妊娠期高血糖診治指南（2022）[第一部分]》的建議定義GDM[11]。簡而言之，在妊娠24～28 周時，口服75 g 口服葡萄糖耐量試驗后，空腹血糖≥5.1 mmol/L 和（或）1 h 血漿葡萄糖≥10.0 mmol/L 和（或）2 h 血漿葡萄糖≥8.5 mmol/L的截斷點來診斷GDM。

1.3 納入與排除標準

納入標準：①所有登記的參與者年齡都在18 歲以上；②參與者胎齡24～28 周；③自愿參與者。

排除標準：①患有其他類型的糖尿病者；②在診斷為GDM 之前（妊娠24～28 周之前），患有心臟、肝臟或腎臟疾病、甲狀腺功能障礙和多囊卵巢綜合征者；③有雙胎或多胎妊娠者；④采用輔助生殖技術的妊娠期婦女；⑤在懷孕期間服用了影響葡萄糖代謝的藥物者；⑥妊娠期高血壓或先兆子癇的妊娠期婦女；⑦酗酒以及藥物成癮的妊娠期婦女；⑧妊娠檢查信息不完整的妊娠期婦女。

1.4 方法

收集妊娠期婦女的年齡、體質指數、妊娠史、既往GDM 病史和糖尿病家族史。采集2 mL EDTA 抗凝的外周血，保存于-80℃待分析。

DNA 分離：本研究使用天根血液DNA 純化試劑盒（天根生物科技有限公司，AP348，北京，中國）分離和純化基因組DNA。簡述如下：①向200 μl 外周血白細胞中加入20 μl 的蛋白酶K，上下顛倒混勻；②向①中加入200 μl GD，輕輕渦旋10 s，并于56℃水浴鍋中孵育10 min，期間顛倒混勻數次至溶液澄清透亮；③將樣本從水浴鍋中取出，室溫靜置數分鐘后，加入200 μl 的無水乙醇，輕輕渦旋混勻后；④將溶液轉移至吸附柱中，14 000 rpm 離心1 min，棄去濾液；⑤向柱中加入500 μl 的PW，室溫靜置2 min，14 000 rpm 離心1 min，棄去濾液；⑥重復④一次；⑦打開吸附柱的蓋子，室溫放置10 min后，向吸附中間位置加入100 μl 的TE 緩沖液，14 000 rpm 離心2 min，所得濾液即為DNA；⑧所有DNA 保存在-20℃直到基因分型。

基因分型：本研究采用已建立的Agena MassARRAY 系統方法對根據先前研究選擇的4 種單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）進行基因分型，包括CDKAL1 rs7754840、IGF2BP2 rs1470579、MTNR1B rs10830962 和TCF7L2 rs7903146。Agena MassARRAY 系統基因分型的方法簡述如下：①使用分析設計套件2.0 軟件來設計合適的引物。②多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR），多重PCR 體系的配置如下：氯化鎂（25 mmol，0.4 μl）、dNTP混合物（25 mmol, 0.1 μl）、引物混合物（1 μM，0.5 μl）、多重PCR 酶（5 U/mL,0.2 μl）、DNA 模板（5 ng/mL, 2 μl）并補充無酶水至5 μl；多重PCR 反應條件如下：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45個PCR 循環；最后72℃延伸5 min。③SAP 反應，反應體系配置如下：SAP緩沖液（0.17 μl）、SAP酶（0.3 μl）以及無酶水1.53 μl；反應條件如下：37℃孵育40 min，85℃失活5 min。④延伸反應：反應體系配置如下：多重延伸反應緩沖液（0.2 μl）、多重延伸反應終止液（0.2 μl）、特異性的延伸引物混合物（0.94 μl）、延伸反應的酶（0.041 μl）；反應條件如下：94℃變性30 s；94℃變性5 s，以下步驟5 個循環：52℃退火5 s和80℃延伸5 s，共40 個循環；最后72℃延伸5 min。⑤反應完成后，將反應板取出室溫3 700 rpm，離心1 min 后，向每個孔中加入樹脂，萬向搖床室溫孵育20 min，除去樣本中的鹽分。⑥采用MassARRAY RS1000 將反應液轉移到芯片上，并將芯片置于質譜儀中獲取反應圖譜。檢測分析流程由瑞因生物科技（廣州）有限公司完成。

1.5 統計方法

采用R 4.1.0 統計學軟件（奧地利研發核心團隊）對數據進行分析，計量資料經檢驗符合正態分布，采用（±s）表示，組間差異比較進行t檢驗；計數資料采用例數（n）和率表示，組間差異比較進行χ2檢驗。SNP 和GDM 之間的關聯通過SNPassoc 2.0.2軟件包實現，并獲取具有顯著性的基因多態性；為了進一步明確妊娠期婦女的發生GDM 風險的風險因素，本研究利用Glmnet 3.0.2 軟件包結合Logistic回歸分析，明確GDM 的風險因素。同時，本研究采用ggplot2 3.4.2 進行可視化。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象基本特征比較

378 例研究對象中經產婦217 例和初產婦161例，孕婦有糖尿病史15 例，研究對象有糖尿病家族史29 例。口服葡萄糖耐量試驗后，被確定患有GDM 90 例。健康孕婦和GDM 孕婦年齡、體質指數、妊娠史、GDM 病史、糖尿病家族史比較，差異有統計學意義（P＜0.05），是其患病風險的高危因素，見表1。

表1 兩組研究對象基本特征比較

2.2 候選SNPs 與GDM 的關聯分析

使用χ2檢驗評估4 個候選SNPs 與GDM 風險之間的關聯。TCF7L2 rs7903146（P=0.038），見圖1C，而不是IGF2BP2 rs1470579（P=0.670），見圖1A，CDKAL1 rs7754840（P=0.430），見圖1B，或MTNR1B rs10830962（P=0.800），見圖1D，與GDM 風險相關。不同遺傳模型和GDM 風險之間關聯。見表2。

圖1 候選基因多態性與GDM 風險的關聯分析

表2 基因型與患GDM 的風險

2.3 識別GDM 的風險因素

為了確定GDM 的危險因素，對流行病學特征進行多變量邏輯回歸分析，包括年齡、體質指數、妊娠史、GDM 病史和糖尿病家族史。年齡、有明顯較高的體質指數、初產婦、有糖尿病家族史的孕婦、TCF7L2 rs7903146 是GDM 的風險因素。見表3。

表3 基于邏輯回歸的GDM 風險多變量分析

3 討論

在本研究中，分析了目前已報道的流行病學特征和遺傳因素與我國妊娠期婦女GDM 的相關性。與以往研究相似的是年齡較大、體質指數、妊娠史、GDM 史和糖尿病家族史是GDM 的危險因素。更重要的是，本研究結果表明TCF7L2 rs7903146 與我國人群的GDM 風險相關，而非CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 和IGF2BP2 rs1470579 等遺傳多態性。

既往研究顯示，TCF7L2 屬于T 細胞因子/淋巴增強因子家族，通常與β-連環蛋白形成堿性復合物，并在肝臟、胰島和脂肪組織中調節經典Wnt 信號通路的下游靶基因[12]。TCF7L2 的主要生物學功能是通過影響β 細胞的胰島素分泌和肝臟糖異生從而調節機體內的糖代謝過程[12]。由于GDM 的主要病理生理學特征是胰島素抵抗和胰腺β 細胞缺陷，因此，TCF7L2 的功能變異可能對GDM 的發生發展具有重要的影響。

本研究發現只有TCF7L2 rs7903146，而非CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962或IGF2BP2 rs1470579，與GDM 風險相關，該結論與以前研究的系統綜述一致[13]。既往研究分析表明，TCF7L2 rs7903146 與GDM 的發病具有顯著的關聯性[14-15]，該變異體可顯著影響TCFL2 的增強子活性從而調節其基因表達[16]。與此同時，已有研究證實GDM和糖尿病之間遺傳易感性的相似性。因此，推測rs7903146 T 等位基因抑制了TCF7L2 的表達，從而降低β 細胞的胰島素分泌，最終導致葡萄糖耐受。當然，本研究發現需要更多的前瞻性臨床研究來驗證。國外一些研究報道，CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 和IGF2BP2 rs1470579 與GDM風險相關[17]，而來自國內的研究者則報道稱MTHFR rs1801133 的GA 和AA 基因型與太倉地區漢族人群GDM 密切相關，A 等位基因可能增加GDM的風險[18-19]。而在本研究中，CDKAL1 rs7754840、MTNR1B rs10830962 或IGF2BP2 rs1470579 與GDM風險之間未見顯著關聯。導致上述爭議性結論的原因可能是診斷標準、基因型方法、樣本量、群體特征和研究設計不同。因此，需要大規模的驗證性研究。

本研究發現年齡較大、體質指數、妊娠史、糖尿病家族史等是GDM 的危險因素。來自馬來西亞的研究報道稱既往GDM 病史的妊娠期婦女發生GDM 風險是無GDM 史的妊娠婦女的8.420倍[20]，而肥胖是GDM 的風險因素[21-22]；此外，部分研究顯示糖尿病家族史、年齡≥25 歲、多次妊娠史、糖尿病家族史是GDM 的風險因素[23]，與本研究一致。

綜上所述，在我國人群中有妊娠史、較高的體質指數、高齡、糖尿病家族史以及攜帶的TCF7L2 rs7903146 CT 基因型的妊娠期婦女患GDM 的風險更高，揭示GDM 的發病相關因素，孕早期做到早預防，降低GDM 的發病率，孕中期做到早發現、早治療，改變可改變因素，如控制體質量增長、調控飲食、適量運動、控制孕前血糖，可有效降低母嬰并發癥，保障母嬰安全。