免疫應答性狀篩選及高免疫力奶牛的培育進展

張志鵬，王大勝，王建輝，王志彬，陳義旺，商紹彬，楊章平，楊 奕*

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009；2.睢寧縣畜牧獸醫技術指導站，江蘇徐州 221200；3.徐州永浩牧業有限公司，江蘇徐州 221200；4.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009）

奶業是關系國民健康的重要產業，奶牛疫病是制約奶業發展的關鍵因素之一。長期高強度的經濟性狀選擇導致奶牛對疫病的抗性普遍下降，因此，基于適應性免疫應答性狀的遺傳選育是提高奶牛疾病抗性的重要策略。近年來，人們開始關注健康性狀的選擇，包括奶中的體細胞計數、奶牛的長壽性等，但一直沒有篩選出能夠反映奶牛綜合抗病性的標志（性狀）。免疫學技術在奶牛抗病育種領域的應用為奶牛抗病性狀的選育提供了新的思路。有研究表明，適應性免疫應答性狀受到遺傳因素調控[1]，其中細胞和體液免疫應答都具有數量性狀特征，可估計育種值，可作為候選性狀用于奶牛抗病性選種，以提高其綜合抗病性能[2]。本文將對這種新興的免疫應答性狀選擇技術在培育抗病奶牛領域中的應用和發展進行闡述，為建立新型可定量且易于標準化測定的奶牛遺傳性免疫能力選擇體系、突破國外奶牛遺傳性免疫應答能力選擇的技術封鎖、攻克高免疫力奶牛種源“卡脖子”技術，培育具有自主知識產權的本土化奶牛高免疫力新品系提供理論依據。

1 奶牛抗病性狀選擇研究進展

自20 世紀末以來，隨著奶業發展和牛只健康等問題的日益突出，對奶牛的選育目標已經由最初產奶、產肉等生產性狀逐步發展為平衡育種，抗病性狀的選育也逐漸受到人們的重視。抗病性選育是主要基于品種和個體對疾病易感性的差異，通過定向選擇的方法培育對特定疾病擁有較強抵抗力的奶牛新品種（系）。一般包含2 部分：一是抵抗常見病、傳染病的選育，二是針對某些遺傳缺陷的選育。奶牛常見疾病包括乳腺炎、瘤胃異位、繁殖疾病、代謝疾病、肢蹄病等，這些疾病的發生會導致奶牛生產性能下降，造成嚴重的經濟損失。目前，圍繞上述疾病已經開展了一些抗性選育工作。

1.1 奶牛特定疾病抗性選擇

現有的研究大多集中在針對某一特定疾病的抗性選育，為此已經開發出從表型到分子選育的多種技術手段。目前奶牛乳腺炎是一個尚未解決的世界性難題，人們試圖通過篩選候選基因開展奶牛乳腺炎抗性育種，Usman 等[3]研究發現，IL-17F 和IL-17A 基因中的單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）奶牛乳腺炎的抗性有顯著相關性，而這些SNP 可以在奶牛抗乳腺炎育種工作中作為有效的遺傳標記。肢蹄病是奶牛養殖中的常見病、高發病，被列為牧場最重要的動物福利指標，目前針對牛肢蹄病的選育主要依賴于選擇體型等間接性狀或根據肢蹄病發病記錄進行直接選育。Matthew Barden 等[4]以蹄病恢復情況為指標，開發了一種新的選育方法，該方法將動物分類為“易感”和“抗病”，在此基礎上建立了牛蹄病選育責任量表，量表顯示，唯一病變易感性的遺傳率為0.25，表明蹄病恢復性狀是可遺傳的。因此，可通過該性狀的選擇性育種減少長期患有蹄病奶牛的概率，為提高牛群的蹄病抗性提供了一種有效的途徑。

對于奶牛育種，無論是通過表型記錄還是分子選育，對單一疾病進行抗性選育的效果均不明顯并存在一系列問題。例如，對奶牛乳腺炎的抗性選育可能會導致產奶量的明顯下降，基于現有抗乳腺炎表型選擇的方法，確定的具有高乳腺炎抗性的奶牛，其產奶量顯著降低[5]。對奶牛進行人工感染特定病原菌后，檢測相關反應的指標也可以用于評估抗性水平，例如對布魯氏菌感染導致的流產進行檢測[6]，但存在疾病暴發的風險，因此這種方法在商業環境中并不適用。此外，有研究表明，對特定病原體的抗性并不具有對其他病原體的抗性，甚至可能發生相反的情況[7,8]。

1.2 奶牛健康性狀選擇

針對單一疾病進行牛的抗性選育是不可行的。為了保證牛的生產性能不受影響，并提高牛的適應性，降低疾病發生率，保證抗病育種工作的持續推進，開展健康性狀的研究和應用勢在必行。目前，美國健康性狀分類指數中包括：乳腺炎、酮病、子宮炎、真胃變位、胎衣不下和產乳熱等6 個健康性狀[9]。因為許多健康性狀的表型數據采集困難，所以在研究中經常將其作為整體考慮，統計特定時間內發生這類健康事件的次數。例如，澳大利亞的育種工作者將胎衣不下、子宮炎等各類繁殖疾病組合稱為繁殖性能障礙類健康性狀，其估計遺傳力為0.01[10]。

保持肢蹄健康對奶牛場非常重要。研究表明，蹄病對奶牛的長壽性和產奶量存在顯著影響[11]。以往的肢蹄性狀健康選育研究大多是被包含在體型外貌性狀中來開展的，牛體型外貌性狀的遺傳評估研究已經進行了很多年，然而，近期的研究表明，肢蹄的健康狀況與體型線性評分之間無顯著遺傳相關性，這表明在今后的抗病育種工作中，在選育目標中單獨加入肢蹄健康性狀是十分必要的[12,13]。牛的肢蹄健康性狀是根據其發病與否定義的一種二分類閾性狀，可使用混合線性模型進行遺傳參數估計。因此，為了選育肢蹄健康性狀，需要經過很長時間的肢蹄疾病診療記錄的積累，這大大影響了選育的效率。為了解決上述問題，各類檢測奶牛行為的智能化檢測系統被陸續開發出來，通過奶牛的行為變化來推測其肢蹄健康情況[14]。研究結果表明，奶牛肢蹄健康性狀估計遺傳力在0.01～0.03[15]。荷蘭和北歐已經將肢蹄健康性狀納入奶牛選育指數中，其權重為3%～7%。

有關乳房健康性狀的遺傳選擇在奶業發達國家開展的比較早，起初主要將乳房深度、前乳房附著和牛奶體細胞數等指標作為乳房健康性狀的標志，以此來間接選擇臨床乳腺炎的抗性，但是臨床乳腺炎抗性的遺傳性能并不能通過上述乳房健康性狀的標志來完全解釋清楚[16]。因此，各個國家陸續開發了臨床乳腺炎的表型數據采集系統，與牛的肢蹄健康性狀相同，牛乳腺的健康性狀是根據其發病與否定義的一種二分類閾性狀，可使用廣義線性模型和線性模型對其進行遺傳參數估計[9]，廣義線性模型遺傳力估計結果（0.06～0.10）高于線性模型（0.01～0.03）[17]。目前，一些國家已將臨床乳腺炎抗性加入了選擇指數中，在法國和加拿大的奶牛選育指數中，臨床乳腺炎抗性的權重分別為7.2%和6.6%[18]。

對奶牛動物福利和生產性能產生影響的健康因素很多，這些因素來源于不同發病機制的疾病，導致健康性狀之間遺傳相關較小。表型數據是影響健康性狀遺傳評估的主要因素，國外的研究人員很早便嘗試直接選擇健康性狀，并構建了特定的數據收集方法和制度以開展相關的研究，然而健康性狀（＜5%）的遺傳力一般比生產性狀（＞30%）低[19]，直接選擇效果較差。

2 免疫應答性狀選擇技術原理與應用現狀

免疫應答是指免疫系統識別和清除入侵的病原微生物以及機體內突變的細胞和衰老、死亡細胞的整個過程，可分為固有免疫和適應性免疫兩大類。固有免疫又稱先天性免疫，適應性免疫又稱獲得性免疫。目前對于奶牛而言，針對固有免疫性狀的測定尚無標準方法，盡管已經有學者開始關注血液中的中性粒細胞數量等性狀，但是選擇的具有高中性粒細胞的奶牛的抗病性能并不理想。相反，適應性免疫已被證明受遺傳影響較大，相應的細胞及體液免疫應答性狀測定方法已被成功開發并應用在了種公牛的選種選育工作中。本文探討的免疫應答性狀選擇技術主要指能在奶牛育種和生產上應用的適應性免疫性狀測定技術。

2.1 免疫應答性狀選擇技術原理

免疫應答性狀選擇技術是加拿大圭爾夫大學等研究人員開發的一種測定奶牛細胞及體液免疫應答性狀的方法，根據該方法將奶牛的免疫力定義為“高、中、低”三個不同的水平，以此來對奶牛的綜合抗病性能進行選擇。其原理是對奶牛注射模式抗原后，檢測奶牛的免疫應答反應程度，以此來衡量細胞和體液免疫應答性狀水平。細胞免疫應答性狀的檢測方法是手動測量VI 型超敏反應引起的皮褶厚度，該方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛產生細胞免疫應答后，再用相同的抗原進行皮試，可誘導遲發型超敏反應。激活的T 細胞會釋放多種細胞因子，產生以單個細胞浸潤為主的局部炎癥反應，陽性反應表現為局部紅腫和硬結，通過陽性反應的強度可以確定細胞免疫的水平。體液免疫應答性狀檢測是通過間接酶聯免疫吸附檢測（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）來測定奶牛血清中的特異性抗體滴度，該方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛產生體液免疫應答后，B 細胞會分泌抗原特異性抗體來保護機體，將該模式抗原包被96 孔酶標板，并通過間接ELISA 測定該抗原免疫后的奶牛血清中的特異性抗體滴度。目前，相關方法已被申請國際專利保護，并被加拿大先馬士育種公司應用于種公牛的選擇，以開發具有高免疫力遺傳物質的凍精產品。

2.2 免疫應答性狀選擇技術應用及優化

研究人員對加拿大荷斯坦牛的細胞及體液免疫應答水平分別進行了遺傳分析，發現這些性狀的遺傳力在0.16～0.41[20]，處于中等水平，說明性狀比較穩定，具有良好的抗病育種應用價值。已有研究表明，在犢牛中，抗雞蛋清溶菌酶和抗人紅細胞抗原抗體水平的遺傳率分別為0.48 和0.31[21]。而另外一項包括了42 個不同品種牛的研究報告指出，細胞和體液免疫應答性狀的遺傳力分別為0.19 和0.16[20]。因此，研究這些性狀與產奶、繁殖和健康等因素之間的遺傳關系，對提高動物健康狀況、適應性和繁殖能力具有重要意義。國外奶牛育種公司篩選了具有高免疫反應的種公牛，并利用其精液進行配種，以提高牛群的疾病抗性。根據國內牛群中的研究：在犢牛階段，高免疫反應水平公牛后代的消化道疾病發病率比普通公牛的后代下降了30.11%；在成母牛階段，高免疫反應水平公牛后代的乳房炎發病率相比普通公牛的后代降低了45.66%（表1）[22]。

表1 不同免疫應答水平公牛后代各類疾病的發病情況[21]

本課題組總結國內外相關研究內容，深度解析了已經被申請專利的現有免疫應答性狀測定技術，并優化了現有技術的免疫方案（圖1）。將原有的1 次模式抗原免疫增加至2 次，并在免疫后的第21 天進行免疫應答性狀的檢測。優化后的方案兼容了免疫記憶效應，可在最大程度上反應被測動物的免疫應答能力，并考慮了免疫應答性狀值的變化幅度，進而使測得的各項數據更加準確。

圖1 免疫應答性狀測定的免疫方案

本課題組現已采用上述優化后的免疫應答性狀測定方法，測定了千余頭中國荷斯坦成年母牛并獲得了一批高、中、低免牛。目前，正在通過單細胞測序和多參數流式細胞術深度挖掘“高免牛”和“低免牛”的新型生物標志物，并采用細胞與分子免疫學方法，通過比較免疫學分析，鑒定奶牛天然免疫能力選擇指標或組合，建立新型可定量且易于標準化測定的奶牛遺傳性免疫能力選擇體系。本研究旨在突破國外奶牛遺傳性免疫應答能力選擇技術的封鎖，攻克高免疫力奶牛種源“卡脖子”技術，并為培育具有自主知識產權的本土化奶牛高免疫力新品系提供理論依據和試驗支撐。

除此之外，根據免疫應答性狀的分類，對牛進行高免、中免和低免的群體劃分，有利于免疫應答性狀在生產實踐中的應用推廣。如圖2 所示，先前的研究使用“四分位數”將不同免疫應答性狀表型的牛劃分為高免、中免和低免牛。該方法避免了因均值和標準差不同所導致的高免、低免牛數量的差異，與生產實際更加吻合。此外，育種值分類已獨立用于高免牛和低免牛的篩選[23]，且研究表明，其與表型分類的結果相一致。Bateman 等[24,25]人利用適應性免疫應答性狀的育種值選擇高免疫反應性和低免疫反應性的豬，研究結果顯示，在第1 個世代中高免疫反應的育種值為0.23，低免疫反應的育種值為-0.17，經過8 代選擇后，高免疫反應性的育種值達到0.47，而低免疫反應性的育種值為-0.08。上述表型和育種值分類均考慮到了動物的遺傳因素，但從商業推廣層面來看，使用表型分類更實際，因此目前主要使用表型分類來鑒定奶牛的適應性免疫應答性狀水平。

圖2 奶牛免疫應答性狀表型分類

Heriazon 等[2]研究表明，細胞和體液免疫應答性狀表型之間呈負相關。在抗原刺激后，B 細胞分泌抗體并發揮體液免疫功能，而T 細胞則分化為細胞毒性T 淋巴細胞及其他功能亞群并發揮細胞免疫效應。在胸腺依賴性抗原（TD 抗原）的識別和清除過程中，B 細胞在提呈抗原后，需要Th 細胞的輔助才能產生抗體；然而對于非胸腺依賴性抗原（TI 抗原），則無需Th 細胞輔助即可刺激機體產生抗體[26]。因此，體液免疫和細胞免疫雖然效應機制不同，但卻是彼此關聯、相互調控的。基于其他動物的研究表明，利用“高體液免疫應答”這一標準篩選出的小鼠和雞，對胞外病原體的感染表現出高抗性，但對胞內病原體易感[27]。因此，在商業應用中，為了培育出綜合抗病能力強的 “高免牛新品系”，建議對細胞和體液免疫應答性狀同時進行測試，并以此定義高免、中免和低免牛。同時，需要對每個免疫應答性狀的表型或育種值進行合理的加權，進而創建一個平衡的指數，以實現兩個性狀的同步遺傳改良，并保持或改進育種指數中包含的其他性狀（例如生產性狀等）。

現有研究表明，與牛群中的普通奶牛相比，具有卓越適應性免疫應答反應的奶牛能夠更好地消除病原菌，并更快地恢復免疫穩態，進而防止乳腺炎等奶牛常見炎癥類疾病的發生[28-30]。一項關于適應性免疫應答性狀對奶牛乳腺炎發病率影響的研究表明，細胞及體液免疫應答性狀與體細胞評分、乳腺炎發病率顯著相關。除此之外，免疫性狀還可能與生產性狀之間存在相互作用關系。在豬中的研究表明，適應性免疫應答性狀的遺傳選擇加快了豬的出欄速度[24]；而在牛中的研究表明，提高產量的遺傳選擇增加了疾病的易感性[31]。因此，將免疫應答性狀納入育種選擇指標是非常具有經濟價值的，并且還可以避免在選擇其他性狀（如產量）時，對免疫應答性狀的選擇可能產生的負面反應。

3 免疫應答性狀選擇技術發展趨勢

免疫應答性狀在牛的育種工作中屬于一個新性狀，目前僅在加拿大、美國等奶業發達國家推廣試用。任何一個新性狀在育種中的應用都是在不斷的實踐中逐漸走向成熟的。通常，隨著行業新需求的產生，研究人員會關注一些新的性狀，并且開展相關的試驗來收集新性狀的數據，進而逐步構建出新性狀的評價方法和體系。通過經濟重要性分析法來確定各性狀在選擇指標中的權重，并收集更大規模的數據來逐步開展該性狀的大規模評價和育種。在該性狀的選育過程中，可以觀察和測試選育效果，并實時調整相應的選育策略和方法。由此可見，針對任何一個性狀的選種選育工作都不是一朝一夕的，需要大量時間積累相關數據，所以選種選育工作要求具備一定的預見性。綜上所述，總結奶業發達國家的育種經驗，并在中國的牛群中進行相關研究是非常有意義的。

3.1 免疫應答性狀選擇技術的新突破

加拿大先馬士公司率先將免疫應答性狀選擇技術應用在種公牛的選育工作中，并開發出了“免疫大師”凍精產品，相關技術已申請國際專利，該凍精產品推向市場后獲得了廣泛的好評。雖然該技術已經被應用于種公牛的抗病選擇，但仍存在很多不足之處。例如，現有的技術需要對牛進行保定，工作量巨大，并且測定過程以人工測量為主，存在一定誤差，因此目前僅用于極少的高經濟價值的種公牛選擇，無法廣泛應用于其他種公牛和后備母牛。除此之外，目前關于免疫應答性狀的相關研究大多集中在表型分析方面，缺乏關于其遺傳機制的研究，在一定程度上阻礙了該技術的推廣。因此，研究者們一直在對相關方法不斷進行完善。

中國市場的奶牛凍精需求量巨大，目前很多牧場已經開始使用“免疫大師”凍精產品。因此，對免疫應答性狀進行研究，挖掘新型生物標志物，尤其是開發新型的、具有我國自主知識產權的免疫應答性狀測定技術十分重要。和美國、加拿大、荷蘭等國家相比，中國在奶牛育種領域的研究還相對落后，對奶牛免疫性狀選育的相關工作更是乏善可陳。通過深入解析奶牛免疫應答性狀的遺傳機制，進而挖掘新型免疫應答性狀標志，建立新型免疫應答性狀測定技術體系，可實現在該領域的“彎道超車”。對此，本課題組在國內外率先進行了不同免疫應答性狀中國荷斯坦牛外周血單個核細胞的單細胞轉錄組測序工作，首次對牛T、B 細胞進行了多亞群的Marker 基因鑒定和細胞注釋，并繪制了中國荷斯坦牛T、B細胞轉錄組圖譜，揭示了不同免疫應答性狀中國荷斯坦牛外周血免疫細胞的異質性。在此基礎上，創新性地建立了用于中國荷斯坦牛T、B 細胞表型及功能分析的七色流式細胞術方案，并利用該方案首次對不同免疫應答性狀奶牛的細胞及體液免疫應答進行了系統而全面的分析，揭示了中國荷斯坦牛適應性免疫應答過程中各T、B 細胞亞群的動態變化及應答機制。本課題組已成功挖掘了可用于評價牛適應性免疫應答能力的T、B 細胞亞群生物標志，并基于新型生物標志開發出一套高效、便捷、標準化的適應性免疫應答水平測定方法。利用以上方法在1000 余頭中國荷斯坦牛中進行了初步試用，選育出的“高免牛”綜合抗病性能顯著提高。目前本課題組正在逐步擴大該方法的應用范圍，進行中國荷斯坦牛“高免新品系”的培育工作。

3.2 與其他育種技術的聯合應用

免疫應答性狀選擇技術與其他先進抗病育種技術的結合是未來的發展趨勢，基因組選擇為改善免疫應答性狀提供了一種具有應用前景的工具。由于免疫應答表型的測量工作相對繁瑣，基因組學檢測可能是一種更好的解決方案，通過使用有關動物遺傳學的可用數據，挖掘與高、低免疫應答相關的遺傳效應，將免疫反應性狀納入基因組育種指數，以改善畜群健康狀況并降低乳腺炎等疾病的發病率。

除此之外，隨著分子生物學技術的發展，其在動物遺傳育種領域的應用頻率日益增加，單細胞測序技術的誕生也為動物遺傳育種相關研究提供了新的技術方法。單細胞測序技術是指對單細胞的基因組進行高通量測序分析，目前該項技術在不同家畜的育種工作中均有應用。在豬的研究中，通過對豬的胚胎細胞進行單細胞轉錄組測序，構建了豬早期胚胎的轉錄組圖譜，發現了很多新的基因[32]，相關結果豐富了豬的遺傳資源，對改善豬的重要性狀具有重要的意義；在牛的研究中，通過對牛的性腺細胞進行單細胞轉錄組測序，系統性分析了牛的原始生殖細胞的遺傳特征，發現牛的生殖細胞系與人類相似[33]。本課題組在該領域也有所探索，利用單細胞轉錄組測序技術深入分析了不同免疫應答性狀的中國荷斯坦牛外周血免疫細胞的異質性，通過對這些細胞亞群的差異基因篩選及功能富集分析，初步揭示了“高免牛”和“低免牛”表現出的免疫力差異遺傳機制，為建立新型可定量、易于標準化測定的奶牛遺傳性免疫能力選擇方法提供了初步的理論依據和試驗支撐。

4 小結

長期高強度的生產性能選育降低了奶牛的抗病性能，疾病的頻發給養牛業造成了巨大的經濟損失，抗生素的使用帶來了潛在的食品安全和公共衛生問題。因此，通過抗病育種提升奶牛綜合抗病能力，是改善奶牛健康、降低疾病發生的重要途徑。傳統的特定疾病抗性選擇和健康性狀選擇周期長、進展小，并且存在生產性能降低和“一病消、多病長”的風險。因此，挖掘能夠反映奶牛綜合抗病能力，并且易于測定應用的抗病性狀或標志是奶牛育種工作中迫切需要解決的重大科學問題。

畜禽免疫學相關研究和新技術的發展為解決上述問題提供了新思路。動物的抗病性能主要取決于自身的免疫系統，適應性免疫應答作為機體抵御感染的“最后一道防線”，具有高效性、特異性和記憶性。細胞和抗體介導的適應性免疫應答分別主要針對胞內和胞外病原體，它們與天然免疫系統分工協作并相互配合。動物的一般抗病性，可以理解為健康性或廣譜抗病性。因此，如果同時對細胞和體液免疫性狀進行選擇，那么對于任何病原體，機體都會擁有良好的自我保護能力，進而實現一般抗病性的遺傳改良。細胞和體液免疫性狀已被證明具有數量性狀特征，是提高奶牛一般抗病性更好的候選性狀，可用于奶牛抗病性選種，根據該表型性狀篩選的奶牛具有較低的傳染性和代謝性疾病的發生率、對疫苗更好的響應和更高的乳品質。然而現有的性狀測定方法周期長、操作程序復雜、成本高、技術要求高，目前世界上僅應用于少量種公牛的選擇，未來還需要對上述測定方法不斷進行優化簡化，以便適用于更大群體的后備青年牛和成母牛的選種選育工作。同時，對相關性狀與疾病深入關聯機制的研究也可能成為一個新的研究熱點。建立新型可定量、易于標準化測定的奶牛遺傳性免疫能力選擇指標以及選擇方法，早期識別和選擇具有高水平先天免疫應答能力的青年牛，提高奶牛健康水平，培育具有自主知識產權的優質、高產、適應性強的本土化奶牛高免疫力新品系，將是奶牛育種領域的重要趨勢。