貴定縣某養鵝場雛鵝死亡病例診斷

張美蘭，冉崇波，杜小敏

貴定縣養殖業發展中心，貴州貴定 551300

隨著畜牧業大力發展，各種鵝類傳染病流行情況越來越復雜，發病率也不斷升高，其中大腸桿菌病、沙門氏菌病和葡萄球菌病等為近年來雛鵝常見的傳染病[1,2]。貴定縣鵝場飼養的4 日齡鵝苗中，部分出現精神沉郁、神態恍惚、機體消瘦、羽毛污濁、食欲減少或廢絕、飲水增多、肛門周圍及后軀被糞便污染、拉白痢等癥狀。養殖戶憑以往經驗最開始采用青霉素治療，但患病雛鵝病情不見好轉，反而持續惡化。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

貴定縣某鵝場患病雛鵝相關病料。

1.2 實驗主要試劑與儀器

試劑：草酸銨結晶紫，蒸餾水，碘液，乙醇，番紅，Marker，MIX，PBS，模板，引物，LB 液體培養基，TBE、1.2%瓊脂糖凝膠。

儀器：PCR 自動擴增儀（TC-412），超凈工作臺（SW-CJ-2D），恒溫搖床，自動雙重純水整流器（SZ-93 型），DYY-10 型（ECP3000）三恒電泳儀；SYGENE 凝膠成像儀。

2 實驗方法

2.1 臨床癥狀與病理變化觀察

對患病雛鵝進行臨床癥狀觀察，將雛鵝呈仰臥式固定在解剖臺上，依次檢查內部各個器官的病理變化。

2.2 細菌分離鑒定

2.2.1 細菌分離培養與純培養

用接種環蘸取少許病料，在瓊脂表面進行來回劃線，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后觀察。然后接種于普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和麥康凱平板上進行純化培養。

2.2.2 細菌染色鏡檢

涂片、干燥、固定、革蘭氏染色、鏡檢后詳細觀察。

2.2.3 生化試驗

將微量生化反應管內液體搖晃均勻后撇成兩段，用接種環挑取純化后的細菌接種到有字體標識的反應管內，另一只作為對照組，做好標記依次排列在凹孔泡沫板上，37 ℃恒溫培養箱培養24 h。

2.2.4 PCR 鑒定

2.2.4.1 16S rRNA 基因序列分析

由貴州大學動物疫病研究室提供細菌通用引物序列，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；下游引物1492R ：5'-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT -3'。

利用16S rRNA 通用引物對分離培養得到的菌株進行擴增和測序，將分離菌株命名為GD。試驗采用50 μL 體系。上、下游引物分別為2.5/μL，MIX 25/μL，模板5/μL，超純水15/μL。反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火為1 min，72 ℃延伸2 min，共30 個循環，72 ℃終延伸5 min,最后4 ℃保存。

2.2.4.2 特異性引物PCR 擴增

挑取單個菌落，接種LB 液體培養基，作好標記放置37 ℃搖床培養12 h，取菌液用貴州大學動物疫病研究室提供的大腸桿菌特異性引物上游引物F:5'-GCAAACAGGATTAGATACCC-3'；下游引物R:5'-CAGCCATGCAGCACCTGTCTCAC-3'進行PCR 擴增，試驗采用50 μL 體系。上游引物2.5/μL，下游引物2.5/μL，MIX 25/μL，模板5/μL，超純水15/μL。反應程序：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性40 s，57 ℃時退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環，72 ℃終延伸7 min，最后4 ℃保存。

PCR 擴增期間，用錐形瓶配置1.2%瓊脂糖溶液，微波爐加熱至透明，搖勻后倒入電泳板中靜置約20 min，冷卻后把瓊脂糖塊放入電泳槽中，倒入適量的1×TBE 緩沖液，分別取10 μL D2000Marke 和PCR 產物用于加樣，進行電泳35 min 后，取出瓊脂糖凝膠，放置于電泳凝膠圖像分析系統中成像。

2.2.5 藥敏試驗

用鑷子夾取藥敏紙片平放于瓊脂平板表面，輕壓貼緊，做好標記，于37 ℃恒溫箱培育24 h，取出觀察測定藥物的抑菌大小。

3 實驗結果與分析

3.1 臨床癥狀與病理觀察

患病雛鵝機體瘦弱，精神萎靡，食欲衰退，呼吸障礙，目腫流淚，雙腿軟弱無力，羽毛松亂污濁，脫水，排白色或綠色糞便，排泄物中混有未消化的飼料，肛門周圍羽毛被糞水污染，干涸后阻礙排糞。通過解剖觀察發病雛鵝，肝臟腫大，變黃，出血；臟器表面有淡黃色的纖維素性滲出物；腸內容物堆積，腸內產氣。

3.2 細菌分離鑒定

觀察到普通瓊脂平板和鮮血瓊脂平板上皆有菌落生長，呈乳白色、扁平、光滑、圓潤、邊緣整齊的中小菌落，在麥康凱瓊脂平板上長出粉紅色菌落；染色鏡檢為兩端鈍圓、中等大小的革蘭氏陰性桿菌。

3.3 生化試驗

分離菌株能發酵葡萄糖產酸產氣，發酵棉子糖、山梨醇、木糖試驗為陽性。

3.4 PCR 鑒定

3.4.1 16S rRNA 基因序列分析

凝膠電泳結果與預期的擴增產物片段1 451 bp大小一致。將PCR 產物切膠回收后測序，測序之后拼接得到有效完整序列,將其命名為GD。而后與NCBI 上其他參考株16S rDNA 基因進行序列相似性分析和系統發育樹的構建，結果顯示GD 菌株與大腸桿菌的NR_114042 序列的score 值為2433，相似度97.63%，同源性較好，根據得到的系統發育樹的拓撲結構以及Bootstrap 值可以看出，GD 菌株與大腸桿菌菌株的親緣關系最近，菌株GD 應同屬于大腸桿菌。

3.4.2 特異性引物PCR 擴增

特異性引物PCR 擴增結果與預期的擴增產物片段275 bp 大小一致。

3.5 藥敏試驗

所測藥物中，對丁胺卡那和米諾環素高度敏感，對氧氟沙星、環丙沙星和多西環素中度敏感，新霉素、慶大霉素、四環素和頭孢唑林等不敏感。

4 討論

鵝大腸桿菌病是由條件致病性大腸埃希氏桿菌引起的局部或全身發病的細菌性傳染性疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫、氣囊炎和肝周炎等一系列疾病[3，4]。這些疾病可獨立發生，也可混合感染或繼發其它疾病共同流行[5]。飼養管理、營養條件、應激等因素都可誘發該病的發生，且發病急，發病率較高，常發生在春冬和秋末季節，是危害養鵝業的主要細菌性傳染病之一[6,7]。該病的主要傳播源是患病雛鵝和帶菌雛鵝；傳播途徑主要為呼吸道、消化道、交配等感染[8]；發病原因多為鵝舍環境衛生差、空氣污濁灰塵多、不重視消毒預防等[9]。應加強飼養管理、保持干凈衛生飼養環境、做好免疫接種，有效預防該病流行[10，11]。

5 結論

5.1 觀察患病雛鵝的臨床癥狀與病理變化，并進行細菌分離鑒定、16 SrRNA 基因擴增和特異性PCR 擴增，診斷結果為大腸桿菌感染所致。

5.2 由藥敏試驗得知，對該鵝場可選用丁胺卡那、米諾環素、氧氟沙星、環丙沙星等進行預防治療。