鯉魚的人工孵化及精子的短期保存

■ 文｜廣東粵海飼料集團股份有限公司 鄭麗明

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 孔德偉 姜松

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚類精子的短期儲存是一種簡單而廣泛使用的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于各種經(jīng)濟和瀕危物種的人工繁殖。精子的短期儲存是指精子在低溫下保存數(shù)小時到數(shù)天的時間，同時精子保持其運動和受精能力的潛力。然而，精子在貯藏期間會發(fā)生表型、生理和遺傳或表觀遺傳的變化，從而影響其受精能力和后代的性能。本文綜述了鯉魚精子短期儲存的研究進展，并對影響鯉魚精子活力和受精能力的因素進行了探討。

一、鯉魚的人工孵化

1.精子和卵子的產(chǎn)生

鯉魚雄性每年每千克體重產(chǎn)生（1.9±0.2）×1012個精子，其中95%以上可以在激素誘導(dǎo)后獲得受精活性，精子濃度在15×109-32×109個精子/mL的范圍內(nèi)。研究表明，精子濃度值根據(jù)品種的不同而變化更大，平均值在7.9×109-19.6×109個精子/mL之間。雌性具有高繁殖力，每千克體重產(chǎn)10萬至30萬個卵。人工產(chǎn)卵期間，鯉魚的生殖力通常較低，雌性生殖力每千克體重產(chǎn)卵數(shù)量范圍從4.1萬到8.6萬個不等，卵的直徑和重量分別為1.24～1.42毫米和0.86～1.41毫克。產(chǎn)卵數(shù)量主要取決于季節(jié)、品種、年齡和魚自身條件等因素。在20～24℃溫度范圍內(nèi)，鯉魚一年可多次排精及產(chǎn)卵。

2.產(chǎn)卵刺激

在繁殖過程中，卵母細胞和精子的最終成熟是由內(nèi)源或合成激素誘導(dǎo)和同步的。鯉魚人工孵化的一般方法為：利用鯉魚垂體誘導(dǎo)精子和排卵，然后采集精子和卵子，卵子和精子的比例是1∶20萬；用孵化水活化，20℃攪拌2分鐘；去除粘性后，將受精卵轉(zhuǎn)移到適當(dāng)容器中，20～22℃孵育；孵育72-96h后，將孵化出的幼蟲轉(zhuǎn)移到孵化槽中。為了短期儲存，將收集的精子用補充劑（110mMNaC l+40mMKCl+2mMCaCl2+1mMMgSO4+10mMTris,pH=8，滲透性310mOsm/kg）稀釋后，在有氧條件下保存在冰上（0～2℃），直到進一步使用。

鯉魚腦垂體（CP）是最常用的刺激最終配子成熟的因子。每毫克片劑含有5～60μg促黃體生成素（LHRH）。將CP溶解在生理鹽水（0.9%NaCl）中，并在背鰭基部和側(cè)線之間肌內(nèi)注射。雌魚的有效劑量約為3mg/kg。注射過程分兩步：首先注射約0.3～0.5mg/kg。首次給藥后12h，再次注射約2.5～2.7mg/kg。雄魚注射量約為0.5～2.0mg/kg。除CP外，鯉魚孵化場還使用GnRH類似物，包括哺乳動物L(fēng)HRH-A（D-Ala6-Pro9-NET-mGnRH）和鮭魚GnRH-A（D-Arg6，Pro9-NET-sGnRH），劑量約為10μg/kg。

3.人工產(chǎn)卵授精

配子成熟后，將親魚麻醉，通過朝向尾部的溫和腹部按摩將雌性的卵母細胞收集在盤或碗中，然后可以類似地將雄性精液收集并混入卵母細胞。向精子和卵母細胞的混合物中加入適當(dāng)體積的激活溶液，如孵化水或鹽溶液（45mMNaCl、5mMKCl、Tris20mM，pH=8），并用羽毛或廚房刮刀混合1-2分鐘，以激活精子活力并確保卵受精。在實驗室條件下，通常使用Bürker細胞血細胞計數(shù)器計算精子濃度，并使用顯微鏡通過目視觀察控制精子活力。授精的最佳精子稀釋度確定為10-2～10-3。研究表明，使用脫氯自來水時，每個卵母細胞的最低精子數(shù)可確保良好受精，孵化率范圍為8500至25000。受精后，卵子迅速水合和膨脹。因此，應(yīng)使用含有堿性蛋白酶、全脂奶粉、白色粘土或單寧酸的溶液，在5-60分鐘內(nèi)消除受精卵的粘性。最后將卵在孵化罐（大規(guī)模生產(chǎn)）或培養(yǎng)皿、塑料碗或孵化器（實驗室）中孵育，直到幼蟲孵化。

二、鯉魚精子的短期儲存

精子短期儲存一般是將精子稀釋到一種叫做“緩沖劑”的溶液或精漿中，使精子在低溫（0～2℃）下保持?jǐn)?shù)小時至數(shù)天的靜止?fàn)顟B(tài)。精子短期儲存在實際生產(chǎn)和科學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用和重要意義。例如，當(dāng)雄性親魚對激素刺激的反應(yīng)比雌性更快，或者雄性數(shù)量有限，或者需要在養(yǎng)魚場之間運輸精子時，精子短期儲存就會發(fā)揮作用。研究表明，精子在體外儲存過程中會發(fā)生ATP的成熟和再生，因此短期儲存有助于誘導(dǎo)睪丸精子、不良精子或性別逆轉(zhuǎn)精子的成熟。

當(dāng)使用緩沖劑時，必須將精子以靜止?fàn)顟B(tài)儲存，直到它們用于受精。由于精子在精漿中是不動的，因此精漿中的滲透壓是恒定的。在使用緩沖劑的條件下，精子受到保護，免受滲透損傷，并保持鞭毛跳動和受精能力所需的ATP來源。精子儲存期間的低溫使精子代謝保持在最低水平。然而，如果儲存時間延長，微生物污染可能會降低精子的活力和存活率。

三、影響精子短期保存的因素

1.溫度

精子與緩沖劑混合物的溫度會影響短期儲存的成功率。Ravinder等人報道了未稀釋的鯉魚精子在室溫（22℃）和低溫（2℃）下分別儲存20和84小時后完全失去了運動潛能，而在5℃的溫度條件下存儲84h后，33%的精子仍可被激活，因此，在5℃和2℃之間的溫度條件對鯉魚精子的具體作用機制值得關(guān)注。在2℃、5℃和22℃保存后，50%精子失去運動潛能的致死溫度（LT50）分別為40h、55h和2.5h。研究表明，低溫對于在孵化場短時間儲存精子是必要的，就像短期儲存在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要經(jīng)濟價值的各種物種一樣，這是因為低溫下精子代謝受到抑制，短期儲存的精子軸突跳動所需的ATP無法獲得。

2.緩沖劑

緩沖劑的化學(xué)成分、滲透性和pH值是短期儲存成功的重要因素，這些因素在精子運動信號傳導(dǎo)中起到重要的生理作用。緩沖劑可保護精子免受質(zhì)膜、基因組（DNA和表觀基因組）、線粒體和軸突的損傷。因此，精子活力的持續(xù)時間比未稀釋保存在緩沖劑中的精子延長。

精漿成分的測定有助于優(yōu)化稀釋劑的成分。精漿含有分別負責(zé)能量代謝和精子運動信號傳導(dǎo)的有機物和離子成分。Na+、K+和Cl-是精漿的主要離子成分，Na+：K+的比例接近1∶1。當(dāng)NaCl、KCl、葡萄糖或甘露醇的滲透壓濃度＜300mOsmol/kg時，鯉魚精子活力可以被激活，這表明精子活力啟動不需要Na+或K+離子。當(dāng)精子以310mOsmol/kg滲透壓濃度儲存時，在150mMNaCl中儲存24-72h后，精子活力、速度〔曲線速度（VCL）和直線速度（VSL）〕和搏動頻率高于150mMKCl。研究顯示，在110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris的稀釋液中，精子儲存效果最佳。

鯉魚精漿的pH值在7.5～8.5之間。研究表明，當(dāng)環(huán)境滲透壓觸發(fā)精子運動啟動時，細胞內(nèi)的堿性pH值是激活動力蛋白 ATP酶所必需的，其值與細胞外介質(zhì)（精漿、精漿擴展器或激活介質(zhì)）的pH值平行變化。用110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris以1:9的比例稀釋鯉魚精子，在pH值為7～9的條件下儲存72h，精子的游動百分率、游動速度（VCl或VSL）和跳動頻率均無顯著差異。研究表明，鯉魚儲存的精子在45mMNaCl、5mMKCl、20mMTris、pH7、pH8和pH9條件下被激活時顯示出相似的運動百分比，這表明，中性和堿性pH的緩沖劑均可為精子提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，以保護其運動潛能。

四、精子形態(tài)、生理生化的短期改變

1.短期儲存對精子形態(tài)和數(shù)量的影響

Saad等人報道了鯉魚在儲存期間異常精子的增加，并利用掃描和透射電鏡描述了短期儲存精子的幾種形態(tài)改變，這些變化包括核膜脫離、線粒體受損、鞭毛卷曲、軸突中央二重微管缺失等。在精子短期儲存期間，精子運動和速度的降低是由于質(zhì)膜和線粒體的破壞，而這些質(zhì)膜和線粒體調(diào)控著精子滲透壓依賴性的運動啟動和ATP依賴性的鞭毛跳動。

研究發(fā)現(xiàn)，精子在儲存過程中會出現(xiàn)精子數(shù)量下降的現(xiàn)象，其下降幅度隨稀釋比和添加量的不同而不同。體外保存8天后，1∶1稀釋的精子數(shù)量減少了22.9%，而未稀釋的精子數(shù)量減少了50.3%。稀釋成1∶1的緩沖劑大大延緩了精子濃度的降低。

2.短期儲存對精子生理生化的影響

精子質(zhì)量（魚齡、產(chǎn)卵季節(jié)、光周期條件和精液收集方法）和儲存條件（溫度、氧氣可用性、稀釋劑成分、儲存時間）是精子短期儲存成功的關(guān)鍵。這些因素可以改變精子的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生和DNA碎片的增加。氧氣對所有活細胞都至關(guān)重要，但其代謝物ROS對精子的運動、速度、新陳代謝、活力喪失和受精潛力等功能有負面影響。在精子儲存期間，氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS，可以損害質(zhì)膜、線粒體結(jié)構(gòu)和呼吸功能。細胞膜中多不飽和脂肪酸的存在使精子的精漿和核膜成為ROS的極好靶點，同時破壞DNA和蛋白質(zhì)ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細胞膜完整性喪失，增加細胞滲透性、酶失活和抗?jié)B透性休克能力。

線粒體是魚類精子的主要能量來源，對精子的運動、完整性和受精潛力具有重要作用。魚類精子運動的激活需要線粒體分泌大量ATP，細胞內(nèi)ATP含量控制著精子運動期的持續(xù)時間。然而，沒有足夠的證據(jù)表明魚類精子在短期儲存過程中，細胞間ATP在線粒體中減少，盡管線粒體的低氧化能力、線粒體膜完整性和線粒體損傷可通過降低細胞間ATP含量來限制精子的運動周期。

五、結(jié)論及未來展望

魚類精子的短期儲存是同步人工受精配子可用性、保存高質(zhì)量精子和改善低質(zhì)量精子或提高水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)濟重要或瀕危魚類人工繁殖效率的有效手段。在鯉魚中，精子可以在體外低溫下短時間儲存。儲存時間過長時，精子失去其運動潛力，其活力和ATP降低，并且精子會發(fā)生膜或基因組和表觀遺傳的改變，導(dǎo)致受精能力降低。當(dāng)短期儲存的精子用于受精時，增加精子與卵母細胞的比例可以補償受精率的下降。