蒙藥紅花益肝丸的質量標準研究

布音 祁峰 陳蘇依勒

紅花益肝丸為阿拉善盟蒙醫醫院（阿拉善盟蒙醫藥研究所）常用院內制劑，別名為古日古木-13味丸，最早出自宇妥·元丹貢布編寫的《四部醫典》中，稱本方為紅花十三味散，18世紀伊希巴拉珠爾編寫的蒙醫藥本草《甘露四部》中有記載，繼后1971年出版的《蒙藥驗方》中詳細記載了紅花益肝丸，1977年昭烏達盟蒙醫進修班編寫的《蒙醫藥方匯編》詳細介紹了紅花益肝丸的組方、功能主治及用法用量等，后《中國醫學百科全書》（蒙醫學）、《蒙藥方劑學》等均記載了該制劑。紅花益肝丸由西紅花、梔子、丁香、麝香等十三味藥組成[1-2]。具有消“黏”，清肝熱，解毒之功效，主要用于肝熱、肝功能衰竭、肝腫大、肝中毒、腰腎損傷、尿頻、“亞瑪”病以及血熱引起的眼病等[3]。該方劑性涼，為治療肝熱病的主要方劑。該方劑以具有清肝熱功能的肝之良藥西紅花為主，以具有清肝熱、解毒功能的牛黃，清脈熱功能的銀朱，清血熱功能的紫檀香、梔子，燥污血、解毒功能的水牛角，消“黏”、解毒、開竅功能的麝香，清“希日”熱功能的唐古特烏頭，平“赫依”、血相訌功能的木香，調元、解毒功能的訶子為佐使，對肝臟諸熱癥均有療效，在臨床上具有良好的推廣應用開發前景。藥品質量標準關系著藥品的安全性、有效性和質量可控性[4]。為有效控制紅花益肝丸的質量，本文采用顯微鑒定法、薄層色譜法對紅花益肝丸進行定性分析，采用高效液相色譜法測定紅花益肝丸中梔子的有效成分，梔子苷的含量，制定科學可行的質量標準，為臨床用藥安全有效提供參考[5]。

1 設施設備與分析試劑

1.1 設施設備

LC-20型高效液相色譜儀（Shimadzu），MettlerToledoXS-205型0.001‰天平（梅特勒-托利多儀器集團），MettlerToledoXP-6型0.000 1‰天平（梅特勒-托利多儀器集團），UB2001i型電子顯微鏡（重慶奧普光電技術有限公司），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），SK720014型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 分析試劑

丁香酚對照品（批號：20201016，供含量測定用）中國食品藥品檢定研究院，梔子苷對照品（批號：110749-201115，供含量測定用）中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層層析板（批號：20210429）天津思利達色譜技術開發公司；紅花益肝丸（批號：2021056-012，20211206-021，20220510-006）由阿拉善盟蒙醫醫院（阿拉善盟蒙醫藥研究所）提供，模擬樣自制；水為高純水，乙腈為色譜純，甲醇、乙醚、石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯為分析純。

2 結果

2.1 性狀及顯微鑒別

2.1.1 性狀

本品為內服丸劑；處方中西紅花為橙紅色，梔子為紅棕色，丁香為暗紅棕色，人工麝香為棕褐色，木香為黃綠色，大托葉云實為灰綠色，唐古特烏頭棕褐色，訶子為黃白色或黃褐色，毛訶子為黃褐色，水牛角（制）為黑褐色，人工牛黃為黃色，紫檀香為紅棕色。將以上藥材粉末混合后以棕色為主，結合多批紅花益肝丸樣品和自制的模擬樣品實際情況，初步確定紅花益肝丸粉末為棕褐色。西紅花味微苦，梔子味微酸而苦，丁香味辛辣、有麻舌感，人工麝香味微辣、微苦帶咸，大托葉云實味苦，木香味微苦，唐古特烏頭味苦，訶子味酸澀后甜，毛訶子味澀、苦，水牛角（制）味淡，人工牛黃味苦、微甘，紫檀香無臭、無味，混合后應有苦味；故定為味苦、澀。西紅花氣特異，微有刺激性，梔子氣微，丁香氣芳香濃烈，人工麝香氣香濃烈而特異，木香氣香特異，唐古特烏頭氣微香，大托葉云實氣微腥，訶子氣微香，水牛角（制）氣微腥，毛訶子氣微，人工牛黃氣清香，紫檀香氣微香，與多批樣品和模擬樣品的氣味相符，故定為氣微。

2.1.2 顯微鑒別

表皮細胞表面觀長條形，壁薄，微彎曲，有的外壁凸出呈乳頭狀或絨毛狀，表面隱約可見纖細紋理（西紅花）[6]。木纖維多成束，長梭形，直徑16～24 μm，紋孔口橫裂縫狀、十字狀或人字狀（木香）[7]。非腺毛易見，為2細胞，基部細胞常內含棕黃色物（毛訶子）[8]。花粉粒眾多，極面觀三角形，赤道表面觀雙凸鏡形，具3副合溝（丁香）[9]。見圖1。

圖1 紅花益肝丸顯微圖

2.2 薄層色譜的鑒別

2.2.1 紅花益肝丸供試溶液的制備

取3批次紅花益肝丸、模擬樣品粉末各1.2 g，加乙醚10 mL，振搖數分鐘，濾過，濾液蒸干，加乙醚1 mL使殘渣溶解，作為紅花益肝丸供試溶液[10-11]。

2.2.2 缺丁香陰性對照溶液的制備

取紅花益肝丸相同比例（缺丁香）、相同工藝制備的樣品1.2 g，同2.2.1項下方法制成缺丁香陰性對照溶液。

2.2.3 丁香酚對照組溶液的制備

取丁香酚對照品5.05 mg，加乙醚5 mL，混勻，作為對照組溶液。

2.2.4 薄層色譜分析條件

吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項下方法制備的3種溶液各1 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點清晰[12]。

2.2.5 薄層色譜鑒定結果

從圖2可以看出，3批次紅花益肝丸、模擬樣品色譜與丁香酚對照組色譜相對應處，顯紫色的斑點，斑點顯色清晰、分離度好。在與陰性對照組色譜相對應處，未顯斑點，無其他組分干擾，故通過薄層色譜可以快速鑒別。

圖2 薄層色譜圖

2.3 高效液相色譜法含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱為ODS-SP C-18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（15∶85）為流動相；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為238 nm。梔子苷峰與相鄰峰的分離度＞1.5[13-14]。

2.3.2 紅花益肝丸供試溶液、缺梔子陰性對照組溶液及梔子苷對照組溶液的制備

2.3.2.1 紅花益肝丸供試溶液的制備 取紅花益肝丸粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理（功率250 W，頻率20 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度、搖勻，慮過，取續濾液，即得。

2.3.2.2 缺梔子陰性對照溶液的制備 取紅花益肝丸相同比例（缺梔子）、相同工藝制備的樣品，按紅花益肝丸供試溶液制備方法制得陰性對照組溶液。

2.3.2.3 梔子苷對照品溶液的制備 取梔子苷對照品3.734 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度。吸取上述溶液25 mL，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。

2.3.3 專屬性實驗

按照“2.3.2”項下方法制備紅花益肝丸供試溶液、陰性對照溶液及對照品溶液，按照“2.3.1”項下含量測定方法分別測定，梔子苷分離效果好，陰性對照色譜在與梔子苷對照色譜相以及紅花益肝丸供試品色譜相對應的時間處無色譜峰出現，表明無其他組分干擾（圖3）。

圖3 高效液相色譜圖

2.3.4 線性關系考察

取梔子苷對照品3.734 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取3、5、7、9、11 μL進樣，按照“2.3.1”項下含量測定方法進行測定，以質量為橫坐標（x），封面積為縱坐標（y）進行回歸分析，結果梔子苷在0.223 4～0.819 0 μg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為：y＝2E+06x-1441.8（r＝0.999 9）。標準曲線數據見表1。

表1 梔子苷的標準曲線數值

2.3.5 穩定性實驗

取同一份紅花益肝丸供試溶液，同“2.3.1”項下色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h測定梔子苷含量，結果紅花益肝丸中的梔子苷含量基本保持不變，表明紅花益肝丸供試溶液在24 h內相對穩定。

2.3.6 精密度實驗

取同一份紅花益肝丸供試溶液，同“2.3.1”項下色譜條件，重復進樣5次進行分析，梔子苷含量差較小，RSD值為0.12%，表明液相色譜儀具有較高的精密度。

2.3.7 重復性實驗

取同一批次紅花益肝丸粉末6份，各約0.5 g，精密稱定，分別按照“2.3.2”項下方法制備，同“2.3.1”項下方法分別進行定量分析，計算得紅花益肝丸中梔子苷的平均含量3.620 mg/g，RSD值為1.97%。表明該方法的重復性良好。

2.3.8 加樣回收實驗

取已知梔子苷含量的紅花益肝丸粉末9份，各約0.25 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇40 mL，分為三組，分別精密加入0.5倍的梔子苷對照品（0.812 6 mg）、等量梔子苷對照品（1.615 1 mg）、1.5倍的梔子苷對照品（2.397 8 mg），分別按照“2.3.2”項下方法制備供試溶液，同“2.3.1”項下色譜條件進行定量分析，計算回收率。結果為梔子苷平均回收率為98.8%。

2.3.9 樣品含量測定

取3批次紅花益肝丸粉末、模擬樣品粉末，各約0.5 g，精密稱定，分別按照“2.3.2”項下方法制備，同“2.3.1”項下方法分別進行定量分析。見表2。

表2 3批紅花益肝丸和模擬樣品中梔子苷定量分析結果

從表中數據可見，3批紅花益肝丸和模擬樣中梔子苷含量均為3.604 mg/g以上，將制備模擬樣品所用同批次梔子藥材的梔子苷進行定量分析，測得梔子苷含量為44.33 mg/g。見表3。

表3 梔子藥材中梔子苷定量分析結果

3 討論

薄層色譜條件選擇：丁香酚薄層鑒別時曾用石油醚（60～90℃）-環己烷、石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯等不同比例的展開劑進行分析，結果發現，石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，此方法簡便易行、斑點分離度好、清晰，可用于紅花益肝丸的快速定性鑒別。

梔子苷提取效率的考察：為保證紅花益肝丸中梔子苷提取完全，實驗中考察了不同提取時間對提取效率的影響。按照“2.3.1”項下含量測定方法進行定量分析，結果超聲處理10 min，提取梔子苷的含量為3.026 mg/g，提取效率較低。超聲處理20 min與30 min，提取梔子苷的含量分別為3.630、3.667 mg/g，梔子苷的含量基本一致，故確定超聲提取時間為20 min。

梔子苷提取溶劑加入量考察：取紅花益肝丸粉末3份，各取0.5 g，精密稱定，分別加入甲醇25、50、100 mL，按照供試品溶液的制備方法制備，在提取過程中，對溶劑加入量進行考察。按照2.3.1項下含量測定方法，測定梔子苷含量，結果，用25 mL溶劑提取的樣品梔子苷含量為2.817 mg/g，較低，用50 mL和100 mL溶劑提取的樣品梔子苷含量分別為3.615、3.608 mg/g，梔子苷含量基本一致，提取完全，故確定提取溶劑加入量為50 mL。

高效液相色譜條件的選擇：以乙腈-水不同比例的流動相進行分析，結果乙腈-水（15∶85）為流動相時，供試品色譜中的目標峰具有較好的分離度，理論板數較高，并具較適宜的保留時間，故選擇乙腈-水（15∶85）為本實驗流動相。

理論板數的確定：根據多批紅花益肝丸樣品及模擬樣品的定量分析得知，梔子苷峰的理論板數在1 500以上即可達到分離所需理論塔板的數量，故確定理論板數在1 500以上。

含量限度的確定：按理論值折算，模擬樣應含梔子苷 3.625 mg/g，轉移率為99.4%。參照《中國藥典》2020年版一部[8]，梔子含梔子苷的量不得少于1.8%。按照處方比例折算，含量低限為1.463 mg/g。考慮到制劑生產中的損耗及不同產地、不同批次梔子藥材質量差異，將含量下浮10%，初步確定紅花益肝丸每1 g含梔子以梔子苷（C17H24O10）計，不得少于1.3 mg，用于控制紅花益肝丸的含量。

綜上所述，紅花益肝丸方中西紅花、木香、毛訶子、丁香的顯微特征明顯，丁香酚的薄層色譜斑點清晰、分離度好、無其他組分干擾，可納入定性鑒別質控標準。梔子苷含量測定的方法重現性好、專屬性強、靈敏度高，可納入定量質控標準，為今后紅花益肝丸質量控制以及臨床應用安全有效提供科學依據。