可逆性腎動脈狹窄大鼠模型的建立與評估

周 爽 ，李學東*，付鴻江，孔宣柱

（1.承德醫學院研究生學院，河北 承德 067000；2.泰達國際心血管病醫院血管外科，天津 300457）

腎血管性高血壓（renovascular hypertension, RVH）通常是由腎動脈閉塞或腎動脈狹窄（renal artery stenosis,RAS）而引起腎臟灌注壓下降，激活腎素 - 血管緊張素 - 醛固酮系統（RAAS），最終導致血壓升高。RAS 引起的RVH 是繼發性高血壓最常見的病因，其中動脈粥樣硬化性腎動脈狹窄（atherosclerotic renal artery stenosis,ARAS）是引起RAS 最主要的病因，約占RAS 患者的80%[1-2]。兩腎一夾腎性高血壓大鼠（2K1C-RHR）模型是研究腎血管性高血壓最常見的動物模型之一，最初有研究應用不同尺寸的銀夾縮窄狗的腎動脈進行模型的制作，從而為RVH 產生的機制及對其他器官影響的研究奠定了基礎[3-4]。然而，由于傳統的銀夾材質軟，易變形，內徑容易發生改變，且容易脫落，往往會造成模型的成功率下降。基于此，本研究使用食品級硅膠管縮窄腎動脈，既可保證RAS 程度一致，又可以避免RAS 的材料脫落，從而提高模型重建成功率。在2K1C-RHR 大鼠模型建立成功后，還需恢復狹窄的腎動脈，以滿足腎動脈血運可以復通的條件，本研究模擬臨床中的腎動脈血運重建的過程，并探究模型的可逆性，為今后研究降壓藥與支架置入術對大鼠血壓的影響奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物55 只體質量為250~300 g 的健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，SPF 級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0005，飼養于天津市濱海新區醫學動物實驗中心。所有動物實驗方案均符合泰達國際心血管病醫院動物倫理委員會相關規定與條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗前的準備 實驗開始前，將大鼠置于帶有墊料的鼠籠，并置于專門飼養大鼠的屏障中，自由進食、飲水，室溫保持在25 ℃左右，對大鼠進行至少1 周的適應性喂養。將50 只大鼠按照隨機數字表法分為狹窄3 d組（10 只）、狹窄5 d 組（10 只）、狹窄7 d 組（10 只）、狹窄14 d 組（10 只）和狹窄21 d 組（10 只），將另5 只同類大鼠作為假手術組。除了假手術組外，其他統稱為模型組。術前3 d 所有大鼠均灌胃阿司匹林腸溶片（石家莊康力藥業有限公司，國藥準字H13024364，規格：25 mg/片），劑量為9 mg/kg 體質量，1 次/d，連續使用3 d。

1.2.2 模型構建及解除腎動脈狹窄方法 術前禁食12 h后，使用裝有異氟烷（天津瑞普生物技術股份有限公司，獸藥字020037015，規格：100 mL/瓶）的小動物麻醉機（天津德鴻盛生物科技有限公司，型號：DHS-MS-3）對大鼠進行吸入麻醉。將大鼠置于37 ℃的恒溫加熱墊上，固定四肢，剃除腹部毛發，碘伏消毒術區皮膚。于肋弓下腹正中線外側偏左0.5~1 cm 處作一長2~3 cm 的切口縱行切開，用組織剪將肌肉剪開相應大小的開口，充分暴露腹腔后，用紗布將左側的結腸和小腸推至右側顯露左側腎臟，將左側腎動脈與腎靜脈分離，管徑較細的為腎動脈，粗的為腎靜脈，如圖1-A 所示。在靠近主動脈處的腎動脈上套入內徑為0.30 mm，厚約1 mm 的食品級硅膠管，如圖1-B 所示。手術結束后，取出腹腔內的紗布，處理干凈滲液，仔細檢查腹腔內無出血和腸管損傷后，恢復腸管的生理位置，然后用5-0 絲線依次間斷縫合關閉腹膜、肌肉及皮膚。假手術組的大鼠除了沒有進行腎動脈縮窄外，其他操作均與模型組相同。術后繼續灌胃使用阿司匹林至解除狹窄的前1 天，劑量同術前。模型組的大鼠分別于術后3、5、7、14、21 d 時拆除軟管，均再次打開腹腔，仔細分離腎動脈周圍組織并取出置入的硅膠管，其中狹窄7 d 組大鼠取出硅膠管后腎動脈如圖1-C 所示。各模型組大鼠取出硅膠管后，仔細檢查腹腔內無出血和腸管損傷后，恢復腸管的生理位置，然后用5-0 絲線依次間斷縫合關閉腹膜、肌肉及皮膚，術后觀察1 h，然后單獨飼養，允許自由進食和飲水。每次手術結束后，各大鼠均肌肉注射頭孢呋辛鈉（深圳信立泰藥業股份有限公司，國藥準字H20000410，規格：0.75 g/支），劑量為0.2 g/kg 體質量，3 次/d，連續使用3 d。

圖1 模型構建及解除腎動脈狹窄示意圖

1.2.3 血壓測量方法 清醒狀態下的大鼠，在腎動脈狹窄模型建立前、解除腎動脈狹窄前、解除腎動脈狹窄后分別用小動物無創血壓測量儀（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：ZS-BPIV）測量收縮壓（SBP）。測量前，將保溫桶調節至適當溫度，并誘導大鼠進入溫度適宜且具有黑暗環境的保溫桶中，用鼠袋裹住保溫筒，將測壓氣囊置于鼠尾根部，待其安靜至少10 min 再進行測量，測量3 次SBP，取平均值。

1.3 觀察指標①比較假手術組和模型組大鼠腎動脈狹窄前后SBP 差值（ΔSBP）。②比較假手術組和模型組大鼠解除腎動脈狹窄前后ΔSBP。

1.4 統計學方法所有數據均使用SPSS 23.0 統計學軟件進行分析，計量資料經S-W 法檢驗均符合正態分布且方差齊，以(±s)表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 假手術組與模型組大鼠腎動脈狹窄前后ΔSBP 比較狹窄3 d 組和狹窄14 d 組的大鼠在狹窄術后各死亡1 只，狹窄21 d 組大鼠解除狹窄后死亡2 只。與狹窄前比，解除狹窄前模型組各組大鼠SBP 均顯著升高，且狹窄14 d 前隨著狹窄時間的延長，SBP 升高越明顯，狹窄14 d 后SBP 升高緩慢，狹窄14 d 組狹窄前后ΔSBP 顯著高于其他各組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1、圖2。

表1 假手術組與模型組大鼠狹窄前后SBP 及ΔSBP 比較(mmHg，±s)

表1 假手術組與模型組大鼠狹窄前后SBP 及ΔSBP 比較(mmHg，±s)

注：與狹窄前SBP 值比，*P＜0.05；與狹窄3 d 組比，#P＜0.05；與狹窄5 d 組比，△P＜0.05；與狹窄7 d 組比，▲P＜0.05。SBP：收縮壓。1 mmHg=0.133 kPa。

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圖2 假手術組與模型組大鼠狹窄前后ΔSBP

2.2 假手術組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較與解除狹窄前比，解除狹窄后模型組各組大鼠SBP均顯著下降；與狹窄3 d 組比，狹窄5 d 組、狹窄7 d 組大鼠的ΔSBP 均顯著升高；狹窄7 d 組大鼠ΔSBP 顯著高于狹窄21 d 大鼠，且狹窄21 d 組低于狹窄5 d 組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3、表2。

表2 假手術組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較(mmHg，±s)

表2 假手術組與模型組大鼠解除狹窄前后ΔSBP 比較(mmHg，±s)

注：與解除狹窄前SBP 值比，□P＜0.05；與狹窄3 d 組比，#P＜0.05；與狹窄5 d 組比，△P＜0.05；與狹窄7 d 組比，▲P＜0.05。

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3 討論

雖然2K1C-RHR 大鼠模型已經廣泛應用于各項研究中，但有文獻報道，用血管夾制作的2K1C-RHR 大鼠和小鼠的模型成功率低[5-6]，其原因是各種材質的血管夾均存在一定的缺陷。制作2K1C-RHR 大鼠模型的銀夾，銀是最早應用于2K1C-RHR 大鼠模型的材料[7]，由于銀的延展性好，易于變形，操作過程中會由于術者的力度不均，導致RAS 的程度不能保持一致，結果將會導致得到的大鼠SBP值不準確。如果狹窄程度輕，則血壓上升緩慢，甚至血壓可能不會發生明顯改變；如果變形嚴重，將會導致其在動物體內極易滑脫，導致模型的失敗率增高。戴勇等[8]用絲線和針灸針縮窄腎動脈，將針灸針與腎動脈平行放置，用絲線將兩者系在一起，然后撤出針灸針，造成腎動脈狹窄。理論上針灸針去除后能夠留出部分空隙，使腎動脈縮窄為理想直徑，實際上，絲線結扎的力度無法保持一致，結扎力度大，狹窄程度大，結扎力度小，狹窄程度小；另一方面，動脈管壁具有較大彈性，即使撤除針灸針，管壁也無法恢復到理想狀態，若結扎過緊會導致腎動脈閉塞。絲線的表面是粗糙的，使用絲線結扎腎動脈會損壞血管壁，易形成血栓，有可能導致腎動脈完全閉塞，模型失敗率增大。用鈦夾和針頭縮窄腎動脈同樣存在弊端，當針頭與腎動脈并行放置時，由于鈦夾呈V 形，使用鈦夾將腎動脈和針頭一起夾住時，夾子會留有一定的空隙，腎動脈也許會滑到空隙中，并不能確保腎動脈被均勻的縮窄成理想中的程度[9-10]；用鈦夾制作2K1C-RHR 大鼠模型，會損傷血管壁，破壞管壁彈性，導致腎動脈無法順利地恢復血運。

綜合以上模型的不足，本研究最終決定采用一種內壁光滑的圓形內徑材料，可以均勻地收縮腎動脈，而且不會對腎動脈管壁造成傷害，受操作者手法的影響小。本研究采用內徑為0.30 mm 的食品級硅膠管收縮腎動脈，大鼠SBP升高明顯。結果可以發現，在狹窄3 d 時SBP 開始升高，并且在狹窄14 d 左右達到高峰，事實證明此方法可以在相對短時間內成功制作RVH 模型。根據研究結果可知，SBP不會隨著狹窄時間的延長無限增高，本實驗腎動脈只有一側狹窄，考慮另一側健康的腎臟會起到代償的作用，因而腎動脈狹窄到一定時間時，SBP 不會再繼續明顯升高，反而會有輕度下降的趨勢，但基本不會下降到正常范圍，腎動脈狹窄程度不同，大鼠SBP 升高程度也不同。

拆除硅膠管后，肉眼可見腎動脈管腔內有血流通過，動脈搏動和管壁彈性仍然存在。選擇肉眼觀察有一定局限性，因此本研究仍然通過血壓變化判斷腎動脈血運是否恢復。由本研究表2 結果發現，拆除硅膠管后，即腎動脈狹窄解除之后，大鼠SBP 下降。使用硅膠管縮窄腎動脈，不僅可以使血壓升高，對腎動脈管壁不會造成明顯的損傷，而且還可以使狹窄后的腎動脈恢復正常血運。此外，狹窄7 d 內SBP 均容易恢復，而狹窄14 d 及21 d 組的SBP 很難恢復到術前的水平，說明狹窄時間越長，大鼠的SBP 越不容易恢復。因此RAS 后應該盡早干預，不應該單純將狹窄程度作為手術標準。

綜上，對于2K1C-RHR 模型大鼠，在狹窄7 d 內解除RAS 其SBP 容易恢復，狹窄時間越長，大鼠的SBP 越不容易恢復，因此建立可逆性腎動脈狹窄大鼠模型是可行的，此模型的建立為今后探索最佳腎動脈血運重建的時機奠定了基礎。本研究不足之處是無法真正模擬臨床中RAS 形成的過程，在RAS 的病因中最常見的ARAS 形成是一個緩慢的過程，今后的實驗中我們擬使用一種可以緩慢膨脹的材料，使大鼠的腎動脈呈一種緩慢狹窄的狀態。